第四章酶分子修饰..docVIP

第四章 酶分子改造 教学目的：使学生了解酶分子改造的意义和酶分子改造的常用方法。 教学重点、难点：酶分子改造的常用方法，酶蛋白侧链基团修饰和氨基酸置换修饰。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节 酶分子修饰概述 一、概述 酶的广泛应用 应用大规模应用酶和酶工艺的尚不够多 酶自身缺点是最根本的原因 不稳定，不适合大量生产需要 工业应用中，常偏离酶最适pH 临床上，外源蛋白质，具有抗原性 改变酶特性的两种主要方法 化学修饰 基因工程技术（蛋白质工程） 二、概念 指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的过程 创造出天然酶不具备的某些优良性状 提高酶活力 增加酶稳定性 消除或降低酶的抗原性，扩大应用范围，提高经济效益 三、酶分子修饰常用方法 部分水解酶蛋白的非活性主链 利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰 酶辅因子的置换等 基因工程、蛋白质工程（氨基酸置换） 第二节 金属离子置换修饰 一、概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法，简称离子置换法 二、原理 金属离子往往是组成酶活性中心的部分，对酶的催化功能起重要作用 金属离子的除去、加入与金属离子的置换 活力改变、稳定性等改变 只适用于本来就含有金属离子的酶？ 三、常用金属离子 Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+、Co 2+、Cu 2+、Fe 2+ 四、操作 酶纯化 EDTA鳌合 透析、超滤、分子筛除鳌合物 加入不同金属离子确定实验结果 五、例 锌型蛋白→钙型蛋白，活力提高20%-30% 杂离子型a-淀粉酶→钙离子型，活力提高并增加稳定性，结晶型活力比一般杂离子型结晶高3倍以上 Fe-SOD→Mn-SOD，H2O2 稳定性增强，NaN3敏感性显著降低 Zn-酰基化氨基酸水解酶→Co型，pH从8.5降低到7.0，Km 第三节 大分子结合修饰 一、概念 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用最广泛的方法。 二、方法 1、修饰剂选择 根据酶分子结构和修饰剂特性选择 右旋糖酐、PEG、肝素、葡聚糖、环糊精、CMC、蔗糖聚合物（Ficoll） 2、修饰剂活化 大分子修饰剂使用前一般要活化，才能与酶分子中相应基团共价结合 考虑酶和大分子修饰剂的空间位阻效应 不同的酶结合的修饰剂种类和数量不同，造成酶功能的改变也不一样，需试验确定最佳的修饰剂的种类和浓度，并注意操作条件 例 PEG：甲基化屏蔽一个羟基得到单甲氧基聚乙二醇（MPEG） 不同类型的PEG衍生物： 聚乙二醇均三嗪衍生物 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 聚乙二醇胺类衍生物 聚乙二醇马来酸酐衍生物 右旋糖苷-（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷 3、修饰 活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应，使两者以共价键结合 4、分离 通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶 三、大分子修饰作用 提高酶活力（空间构象改变，利于底物结合） 1分子核糖核酸酶 + 6.5分子右旋糖苷—酶活提高2.25倍 1分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷—酶活提高原来的 5.1倍 1分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷—酶活提高5.1倍 增加酶的稳定性 降低或消除酶蛋白抗原性 精氨酸酶（抗癌）经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低或消除 L-天门冬酰胺酶（治疗白血病）经PEG或右旋糖酐结合修饰其抗原性完全消除 第四节 肽链的有限水解修饰 一、概念 利用在限定肽链上的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 二、 原理 利用高度专一性的酶蛋白水解特定肽链，除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，使其空间构想发生改变，利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，从而显示出酶的活性或提高酶活力 同时，分子量的降低，可减弱或消除酶的抗原性 第四节 肽链的有限水解修饰 三、例 胃蛋白酶原的激活（N端失去44 aa） 天门冬氨酸酶用胰蛋白酶从末端水解切除10个AA残基，酶活可提高4-5倍以上 枯草杆菌中性蛋白酶，先用EDTA处理。再用稀盐酸缓冲液透析，使酶部分水解，得到仍有酶活性的小分子肽段，做消炎剂使用时，不产生抗原性 第五节 酶蛋白侧链基团修饰 一、 概念 利用各种物质与组成蛋白质的AA残基上的功能团（侧链基团）进行化学反应，引起侧链基团组成的这些副键发生改变，从而使酶空间结构发生某些改变，使酶的特性和功能发生改变的方法。 二、几种重要的修饰反应 1、酰化及其相关反应 2、烷基化反应 3、氧化和还原反应 4、芳香环取代反应 三、特定氨基酸修饰 1、羧基修饰 2、氨基修饰 卤代乙酸、芳基卤、