实验四 线粒体和液泡系的超活染色与观察课件.ppt

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性较小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹姆斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。 詹纳斯绿 B是线粒体的专一性活体染色剂，线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 中性红为弱碱性染料，3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐。对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶能使詹姆斯绿B保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。 液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性红是液泡的特殊染色剂，将液泡染成红色。在活细胞中，细胞质和细胞核不着色。如果细胞死亡，染料会弥散开来，使核着色。 三、实验用品 （一）器材 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸等。 （二）试剂 1、Ringer 溶液 氯化钠0.85g（变温动物用0.65g） ；氯化钾 0.25g ； 氯化钙 0.03g ；蒸馏水100ml 2、10%、1/3000中性红溶液 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30~40度）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 3．1%、1/5000詹姆斯绿B溶液 称取50mg詹姆斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加 微热（30~40度）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 （三）材料 人口腔上皮细胞 小麦根尖细胞 四、实验步骤 （一）线粒体的超活染色与观察 1、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量虽不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。 1）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 ⑴取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。 四、实验步骤 ⑵实验者用牙签宽头在自己口腔颊部粘膜处稍用 力刮取上皮细胞，将第一次刮下的粘液状物洗 去，将第二次刮下的粘液状物放入载玻片的染液 滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥， 必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸 吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。 ⑶在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高 倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核 周围胞质中分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或 短棒状的结构，即线粒体。 二、液泡系的超活染色与观察 中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高 尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的 液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着 色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 小麦根尖细胞液泡系的中性红染色观察 ⑴　实验前，把小麦培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根生长到1cm以上备用。 ⑵　用双面刀片把小麦幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色5～10min。 ⑶　吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。 ⑷　在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞