14.遗传病的诊断2013课件.ppt

[教学要求] 1．遗传病的临床诊断：病史采集；症状和体征；系谱分析。 2．细胞遗传学检查：染色体检查，FISH技术；性染色质检查。 3．生化检查：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。 4．基因诊断：基因诊断的定义和特点；基因诊断的方法：限制性片段长度多态性分析、Southern印迹杂交、聚合酶链反应分析（已知点突变的检测、未知点突变的检测、基因缺失的检测、RCR-RFLP）、DNA测序、DNA芯片、荧光原位杂交等的原理、操作和应用。 第一节 遗传病的临床诊断 一、病史采集 家族史：有无同种病史； 婚姻史：婚龄、婚次、配偶健康情况及是否近亲结婚； 生育史：生育年龄、生育子女数目及健康状况，有无流产、死产和早产史 。 二、症状和体征 二、症状和体征 二、症状和体征 四、遗传数据库资源应用 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ) 四、遗传数据库资源应用 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ) 第二节 细胞遗传学检查 一、染色体检查 取材：视检查对象和目的而有所不同，通常主要取自外周血、皮肤、骨髓、胸、腹水、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血等各种组织。 体外细胞培养 制片：秋水仙素处理，收获细胞、低渗、固定、滴片等过程，制备染色体标本。 显带 核型分析 ① 不明原因的智力发育不全、生长迟缓者； ② 先天性畸形（包括两性内外生殖畸形）； ③ 性征发育异常及生育异常： 原发性闭经和女性不孕症； 无精子症和男性不育症； 有反复多次早期流产史的妇女及其丈夫； ④家族史：家族中有染色体异常或先天畸形的个体。 ⑤ 有较长时间、较大剂量射线或致畸致突变物质接触者； ⑥ 恶性肿瘤，尤其是恶性血液病患者。 二、性染色质检查 X染色质和Y染色质 适应症：两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断，但仍需染色体检查确认。 1、代谢产物分析 2、酶和蛋白质分析 材料主要来源于血液和特定的组织、细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞、肾、肠粘膜细胞等。 产前诊断中常采集绒毛、羊水、脐带血和皮肤。 新生儿的筛查最常用的标本是血和尿。 1978年，美国科学院院士美籍华裔科学家YW Kan(简悦威 )和Dozy应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰状细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。 基因诊断概述 人类基因组计划—— 基因结构 后基因组计划—— 基因功能 基因诊断的一般流程 对基因检测结果的理解 找到功能性突变：支持临床诊断 未找到功能性突变：不否定临床诊断 遗传病基因诊断的分类 临症诊断——家系先证者或患者 症状前诊断——家系高危个体 产前诊断——家系高危胎儿 二、基因诊断基本方法 1．Southern印迹杂交 分子印迹杂交(Southern blotting)的基本方法：DNA标本用限制性内切酶消化→琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段→DNA转印至硝酸纤维素滤膜→标记探针杂交→显影→确定探针互补的每条DNA带的位置，以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 2．聚合酶链反应分析 （1）产物探针检测 ——ASO探针 等位特异性的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide，ASO)探针: 当某一致病基因的突变位点的性质以及突变位点两侧的碱基序列都明确的情形下，可以合成ASO探针。 （2）产物构象变化检测-SSCP DNA单链构象多态性(single strand conformation polymorphisms,SSCP)：相同长度的单链DNA可因碱基序列不同产生构象差异，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为迁移率差别。 提取DNA→PCR扩增→产物变性→电泳 根据单链条带位置的改变判断该个体是否存在突变。 并不是所有的碱基突变都会导致SSCP，因此该方法不能鉴别所有突变。 基因缺失时可导致靶DNA模板的缺失，使用特异性引物扩增时得不到相应的扩增产物，因此可以直接检测缺失。 案例9-2基因诊断分析(P99) DNA测序即测定DNA的一级结构中碱基的顺序。 包含特定位点的PCR产物再作DNA测序，比较正常基因与突变的序列，可检测出突变的碱基类型和位点。 6．荧光原位杂交（FISH） 非放射性原位杂交方法 用特殊荧光素标记DNA探针，在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，检测细胞内DNA或RNA的特定序列存在与否。 案例19-1 罗xx ，女，34岁，曾生育过一个智力低下患儿，现再次妊娠，因惧怕再生同病患儿前来咨询。其