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第八章 免疫分析(三) 自动化免疫仪器种类（应用技术） 免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 免疫比浊 利用抗原抗体结合后溶液的浊度变化而检测的一种方法 此法准确快速，已成为免疫诊断技术中重要的检测手段 比浊法与比色法 散射免疫比浊分析法 免疫透射比浊 基本原理：检测信号是通过溶液的光，测量角度与正前方夹角为0℃，保持抗体过量，形成可溶性AG-AB复合物，使介质浊度发生改变。 实验要求： 选择亲和力高的抗体，抗原抗体复合物要大、数量要多，反应时间充分。 胶乳浊度测定法 基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比（图） 影响免疫比浊的因素 抗原抗体比例 抗体纯度和效价 增聚剂（PEG） 自动免疫浊度分析仪的要求 校准程序，使仪器处于正常的工作状态 定标程序，保证检测结果的准确性 自动控制，保证实施实验条件中的抗原抗体反应体系要求 自动系统，障碍的检测和预警。 化学发光自动免疫分析 化学发光是指在化学反应过程中产生光的发射现象 基本原理：标记在抗原或抗体上的发光物质在碱性介质中氧化时产生激发态的中间体，中间体回基态时产生辐射，多余的能量为发射光子，产生发光现象，再对光信号进行接收转化，可得检测物浓度 发光物质须具备：氧化致发光、光量子产额高、理化性能好 化学发光自动免疫分析类型 化学发光免疫分析（CLIA） 是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。 化学发光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。 微粒子化学发光免疫分析（ECIA） 也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。 电化学发光免疫分析（ECLIA） 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的灵敏度大大提高 以双抗体夹心法为例之图示（图） 化学发光免疫分析是免疫技术、发光技术和计算机系统的结合，具有特异性强、灵敏度高（pg/ml)、精密度好、准确度好等特点，越来越多的人体微量指标应用这种方法来检测，已渐渐代替了RIA。 流式细胞仪 流式细胞仪（FCM）是以激光为光源，检测生物学颗粒理化性质的仪器 生物学颗粒包括免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细胞、染色体、真核细胞等 理化性质则为细胞大小、形状、胞浆颗粒、DNA含量、酶活性等 FCM综合了激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学及计算机技术，被称为实验室“CT” FCM现正广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检验学等 流式细胞仪基本原理 基本原理：单个经荧光染料染色的细胞经过激光激发后，发射的荧光在不同的角度进行测量，并对其信号进行综合分析（图） 细胞分选原理：通过测量区的细胞若其参数符合实验设计的条件，在经过偏转板时被充上相应的电荷并被偏转收集（图） 流式细胞仪基本组成 液流系统：样本和鞘流液组成（图） 光学系统：光源可为汞灯或激光 信号接收系统：散射光和荧光的检测 荧光测量 荧光染料染色的细胞通过测量区时，细胞中特异性荧光物质受激发产生荧光信号，后者强弱表示待测物质的多少 荧光的检测系统由滤光片和检测器组成，滤光片的作用是使激发光波长尽可能接近荧光染料的激发光谱峰值，滤除非荧光信号，提高荧光的检测强度 流式细胞仪免疫分析的技术要求 仪器性能指标：荧光分辨率、荧光灵敏度、前向角散色光灵敏度、前向角散光分辨率、分析/分选速度、分选纯度、分选收获率 检测样品要求要单细胞悬液 荧光标记常用的染料有异硫氰基荧光素、藻红蛋白类 全程质量控制 流式细胞仪的临床应用 细胞生物学：周期分析 免疫学：与单克隆抗体结合应用，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性等方面都起着相当重要的作用 肿瘤学：基因水平的分析，为肿瘤的诊断、治疗及预后评价提供重要的信息 血液学：分析正常细胞与肿瘤细胞 ECLIA体系结构图 ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成） ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合） ECLIA检测流程