Lec9-1_explore proteins-st课件.ppt

* 羧甲基带负电 二乙基氨基带正电 原理 亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。 将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。 Affinity Chromatography * 原理：蛋白质表面的疏水基团与介质的疏水配体的可逆相互作用，高浓度的盐增强相互作用，低浓度的盐减弱相互作用 方法：高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。 Hydrophobic Interaction Chromatography Gel filtration by HPLC clearly defined the individual proteins because of its greater resolving power: thyroglobulin (669 kd), catalase (232 kd), bovine serum albumin (67 kd), ovalbumin (43 kd), Ribonuclease (13.4 kd) High pressure liquid chromatography 高效液相色谱（HPLC）利用高压泵加速蛋白质分子沿着柱子向下运动，并使用能耐高压的高质量层析材料。 通过减少过柱时间，可限制蛋白质条带的扩散，提高分辨率。 电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。 电泳（ Electrophoresis） υ: velocity of migration; E: electric field strength; z: net charge; f: frictional coefficient. η: viscosity of the medium; r: radius of sphere 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF） 双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ） 蛋白质常用电泳技术 Acrylamide Polymerization Polyacrylamide is a useful polymer for gel electrophoresis because both the concentration and cross-linking of the gel can be precisely controlled. Pore size is directly controlled by acrylamide and bis concentration 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。 改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS boiling 十二烷基磺酸钠 SDS: Sample + SDS + Mercaptoethanol /DTT (dithiothreitol) Boiling Running in gel Coomassie Staining / Silver staining / Western blotting / Autoradiography. Dithiothreitol stain by Coomassie blue * 电泳法测定未知蛋白的分子量 The electrophoretic mobility of proteins in SDSis inversely proportional to the logarithm of their mass. 等电聚焦电泳(Isoelectric focusing—IEF) 用来确定蛋白质等电点(pI)的方法。 通过低相对分子质量有机酸和碱（两性电解质）混合物在外加电场的凝胶中的分布可建立一个pH梯度。 当蛋白质移动到pH=pI时，净电荷数为零，停止运动。 不同等电点的蛋白质在凝胶中有不同的分布。 第一向通常根据蛋白质的等电点不同进行等电聚焦电泳，然后再根据分子质量的不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳作为第二向。 能提高分辨率，是一种比单一电泳更敏感的分析方法。 可分离相同相对分子质量而等电点不同的蛋白质，或相同等电点但相对分子质量不同的蛋白质。 双向电泳技术是蛋白质组学研究