[小木虫emuch.net]4课件.ppt

工业微生物菌种选育技术 链霉菌基因工程 为什么链霉菌？ 链霉菌的重要性 产生绝大多数已知的抗生素 生物合成机制的阐明 生产工业用酶的潜力 葡萄糖异构酶 蛋白酶 纤维素酶 木聚糖酶 。。。 放线菌生活史 克服宿主限制性修饰系统 甲基化缺陷的大肠杆菌宿主 用lividans作为过渡 PCR获得DNA 单链DNA 原生质体热处理 体外去除甲基化修饰 突变株宿主 接合转移的优点 免除原生质体制备、再生 降低限制修饰作用 完善的质粒载体 穿梭质粒 pSET152, oriT 接合转移 参考书 Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual 链霉菌遗传操作手册 Practical Streptomyces Genetics 将目的基因克隆到标准宿主菌，然后检测个别基因产物 Target gene:灰色链霉菌中与杀念菌素生物合成有关的对氨基苯甲酸(PABA)合成酶基因pab。 宿主和载体：变青链霉菌，BamHI片段插入到pIJ41的BamHI位点 筛选方法与结果： 以过量产生PABA的灰色链霉菌的磺胺抗性株为供体，在硫链丝菌素抗性转化子中选择磺胺抗性克隆子； 以野生型为供体，pab营养缺陷型为受体选择原养型克隆子。结果从两种选择方法中各获得一个克隆子，每个克隆都带有45kb的BamHI片段 方法1续 Target gene:抗生链霉菌中与放线菌素生物合成有关的吩噁嗪酮(phenoxazinone)合成酶(PHS)基因。 宿主和载体：变青链霉菌66，SphI片段克隆到pIJ702的SphI位点上。 筛选方法与结果：从5000个硫链丝菌素的抗性转化子中检测从3-羟基蒽林酸产生黄色朱红菌酸的转化子，获得了三个克隆子，其中一个携带了编码PHS结构基因的2.45kb的SphI DNA片段，另外两个各含有1.77kb和4.28kb的SphI片段。当转入变青链霉菌后，起激活变青链霉菌染色体上沉默基因的作用。 本方法的优点是不需要了解抗生素生物合成途径的遗传信息，但要知道何种酶参与了生物合成以及具有检测这种酶的灵敏的分析方法。 克隆与阻断突变株互补的基因 抗生素的生物合成途径通常涉及到10～30酶反应步骤，如果通过诱变的方法使其中的一个酶失活，而使其不能合成最终产物，这种突变株称为阻断突变株（Blocked mutants）。如果克隆了一段外源基因而使抗生素的合成恢复，表明这段基因互补了原先失活的酶基因 Target gene: 天蓝色链霉菌中十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因。Blocked Mutants：首先用紫外光诱变天蓝色链霉菌，经筛选获得37个不产Red的突变株，通过共合成试验将突变株分成5类(red A～E)，每组的代表已在天蓝色链霉菌染色体上作出了一簇紧密连锁的位点图。 宿主和载体：阻断突变株red E60，将天蓝色链霉菌的 DNA用BclI和PstI完全酶解或MboI部分酶解，将这些DNA片段分别插入pIJ702的BglII、pIJ350的PstI或pIJ922的BamHI位点。 方法2续 筛选方法和结果：从硫链丝菌素抗性转化子中检测红色菌落的克隆子。获得的21kb的片段能互补4类阻断突变株(A、B、E和F)，这表明Red生物合成基因位于这段DNA上。 除了十一烷基灵菌红素的有关基因外，采用互补克隆的方法还克隆了许多其他抗生素的生物合成基因，其中包括放线紫红素(pIJ2303，35kb MboI片段插入到质粒pIJ922的BamHI位点)；棒酸(pWO1和pWO2，MboI片段插入到质粒pIJ702的BglII位点，这两质粒均含有2kb的同源部分)；链霉素(pSSB1，10.1kb，PstI片段插入pIJ385)；碳青霉烯(carbapenem)；Tetracenomycin C(BamHI DNA片段克隆到pIJ702 BglII位点，12.9kb的DNA与9个突变株中的7个互补)；除虫菌素； 福提霉素 (fortimicin)；Nikkomycin；柔红霉素等九种抗生素的生物合成基因。可见，突变互补是克隆抗生素生物合成基因最成功的方法之一。 这个方法成功的先决条件是获得抗生素生物合成途径被阻断的一系列突变株，这并非是容易做到的事；此外，还需建立以阻断突变株为宿主的载体宿主系统，由于抗生素产生菌限制作用的普遍性，有时建立这样的载体宿主系统也是很困难的。 利用突变克隆分析生物合成基因簇 突变克隆技术是指外源基因借助载体进入抗生素的产生菌中，如果外源基因与抗生素产生菌的生物合成基因有同源性，就有可能与产生菌的转录单位杂交，造成该基因的转录中断而影响其表达，以此来确定克隆基因的性质。 Target gene：位于质粒SCP1（未分离到）上的次甲霉素A生物合成