基因工程第三组--核算的提取课件.pptVIP

DNA纯化要求 核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然. 基因组DNA－ CTAB法 TrisHC（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 离子抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 DNA提取基本步骤 RNA提取及常见问题分析 RNA提取及常见问题分析 RNA提取相关知识 RNA提取方法及注意事项 RNA提取常见问题分析 细胞中RNA的含量 107?个细胞 10μg 30mg动物组织 30-100mg植物组织 rRNA?占80-85% mRNA占1-5%? mRNA的应用 RT-PCR,?Northern杂交,cDNA文库构建 mRNA末端快速扩增(RACE),差异表达(DDRT-?PCR),引物延伸反应,体外转录RNA标记,RNA?酶保护试验,RNA微注射(RNA?Microinjection) RNA的不稳定性 内因:核糖残基的2’和3’位置带有羟基,易 被水解 外因:内源、外源RNA酶含量丰富,加热后仍 能够正确折叠恢复活性,不易失活 提取RNA的注意事项 经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有?RNase,会导致RNase污染 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时,再灭菌 玻璃器皿可在180℃烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染 常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯(DEPC?) 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 异硫氰酸胍 目前是最有效的RNA酶抑制剂,裂解组织的同时也使RNA酶失活。 常用的RNA酶抑制剂 RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合,使其失活 氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性 SDS、尿素、硅藻土等 RNA提取流程示意图 研磨或匀浆 RNA提取流程示意图 RNA提取基本步骤 RNA提取基本步骤 RNA提取基本步骤 RNA提取基本步骤 DNA 和RNA提取常见问题及注意事项 核酸提取方法在不同材料中的改进 核酸提取方法在不同材料中的改进 对于不同的材料相对应的改进方法不同 ，我们简要为大家介绍几种： 可以采用不同氯化钠浓度比差别法来抽提DNA蛋白,得到一个较为理想的氯化钠浓度（不同植物所需浓度不同）;用SDS处理材料后再用氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，并且用十二烷基硫酸钠代替十二烷基磺酸钠配制SDS能够更方便、易配；加入乙醇脱水析出DNA时，则通过用旋转法作顺时针摇动析出DNA代替用滴泵反复吸乙醇析出的DNA,使脱水析出的丝状DNA能顺着势能相互缠绕成团析出,确保丝状DNA分子不被人为断裂。 核酸提取方法在不同材料中的改进 在葡萄总DNA的提取方法改进中，党尉,尉亚辉等以葡萄幼叶为材料,分别采用溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法、高盐低pH法、简易法、高盐沉淀法和改良十二烷基硫酸钠(SDS)法5种方法提取总DNA，对所得DNA溶液进行定量、定性分析和综合比较。结果显示高盐低pH法、高盐沉淀法综合效果较好,改良SDS法所得DNA纯度最佳。 马利华，武安全等则巧用DNA凝胶回收柱提纯种子RNA。禾谷作物种子中含有大量淀粉，由于多糖与RNA溶解性非常相似，所以很难提取和纯化其中的RNA。而经过尝试，发现 DNA 凝胶回收柱不仅可用于纯化回收琼脂糖凝胶上的 DNA，同样可用于纯化富含多糖的植物 RNA。该结合法避免了先提取再纯化的繁琐操作，省去了苯酚-氯仿的抽提，免去了 RNA 反复沉淀溶解等步骤。试验结果表明该方法是一种简捷、高效，能较为彻底除去种子RNA中的多糖杂质的新方法。 核酸提取方法在不同材料中的改进 朱新霞，艾尼江等则采用改进的CTAB法同步提取棉花DNA和RNA，他们在水相中加入licl溶液在-20℃放置一段时间后，则RNA会特异性的沉淀下来，而DNA会继续留在水相中，通过离心可使RNA分离出来。而留在上清液中的DNA会和预冷的异丙醇较快生成絮状物被分离出来。提取步骤中使用的乙酸钠和低浓度的乙醇，不仅可以帮助去除多糖，还可以去除色素类物