生化实验2 电泳课件.ppt

* * 实验3　血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins） 遵义医学院生物化学教研室 朱 欣 婷 实验 思路 蛋白质的理化性质有哪些？ 蛋白质的分离方法有哪些？ 本次实验利用了哪个性质？ 生物化学教研室 朱欣婷 1.掌握电泳法分离蛋白质的原理； 2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理和方法； 3.进一步熟悉721型分光光度计的使用 　　　　 生物化学教研室 朱欣婷 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 生物化学教研室 朱欣婷 （一）电 泳 技 术 (electrophoresis) 电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性 相反的电极移动的现象。 电泳技术:指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。 生物化学教研室 朱欣婷 一、电泳的原理 以蛋白质为例： H＋ OH－ H＋ OH－ pHpI pH=pI pHpI 生物化学教研室 朱欣婷 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度 生物化学教研室 朱欣婷 二、影响电泳速度的因素 1.样品本身： 分子带电量： 分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。 球形分子 纤维状分子 分子大小： 生物化学教研室 朱欣婷 Q越多，u越大； 分子小，r越小，u越大； 2.缓冲溶液： pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大 离子强度(I)： I越大，电动电势越小，u越小； I越小，电动电势越大，u越大， 但样品易扩散。 离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。 生物化学教研室 朱欣婷 电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。 3.电场强度(X) X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。 电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。 生物化学教研室 朱欣婷 4.支持介质： 目前常用的电泳支持物： ①纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜) ②凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶) 生物化学教研室 朱欣婷 负极 正极 － － － － － － － － 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。 电渗作用： 电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 生物化学教研室 朱欣婷 以纸电泳为例: （一）按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为： 1．滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜)电泳 2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳； 3．凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。 三、区带电泳的分类 生物化学教研室 朱欣婷 （二）按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： 1．平板式电泳：支持物水平放置； 2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳； 3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳 生物化学教研室 朱欣婷 (三)按pH 的连续性不同，区带电泳可分为： 1．连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。