生化试验-醋酸纤维薄膜电泳法分离课件.pptVIP

实验七 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白 一、原理 蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。 本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。 血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。 用醋酸纤维薄膜作蛋白电泳有简便，快速，分离清晰，容易定量等优点。 二、实验仪器 1、? 牛血清 2、? 醋酸纤维薄膜 3、? 镊子 4、? 电泳仪 5、? 电泳槽 6、? 盖玻片 三、实验试剂 1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。 2、?染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。 3、?漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。 四、试验步骤 1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。 2、点样：取盖玻片一块，用玻璃棒将血清均匀的涂在盖玻片的一端面上，直直的在薄膜一端1/3处点样。 3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。 4、?染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。 5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。 6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。 注意事项 请带试验的老师试验结束后，将镊子回收。 醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面。 电泳槽中间为正极，两端为负极。 染色液请用完后回收到原来的试剂瓶中。 漂洗薄膜时，请做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，这样既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。 实验十二 维生素C的定量测定（2，6-二氯靛酚滴定法） 一、原理 维生素c又称为抗坏血酸，其还原型能还原染料2，6-二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。 在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成红色，被还原后变为无色。 因此可用2，6-二氯靛酚滴定样品中含有的维生素C，当样品中的维生素C被完全还原后，在滴加过量的2，6-二氯靛酚，溶液变为淡红色，即为终点。 如无其他杂质干扰，则样品液所还原的2，6-二氯靛酚的量与样品中所含有维生素C的量成正比。 二、实验仪器 新鲜水果 吸管 容量瓶 滴定装置 锥形瓶 研钵 漏斗 三、实验试剂 1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。 2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸馏水。 3、标准维生素C液：准确称取10.0mg维生素C，溶于1%草酸溶液，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配制。此溶液浓度0.1mg/ml. 4、0.1%2，6-二氯靛酚溶液：称取500mg2，6-二氯靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氢钠的热水中，冷却，加蒸馏水并稀释至500ml，滤去不溶物，贮于棕色瓶中，冷藏。 四、实验步骤 1.样品中抗坏血酸的提取： 将水果用水洗干净，用滤纸吸取表面水分。 称取2.0g，加2%草酸试剂10ml置研钵中研成浆状。 直接将浆状物，倒入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液稀释并定容，混匀，静止10分钟，过滤（最初数毫升滤液弃去），滤液备用。 2.滴定 1) 标准液的滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml于100ml锥形瓶中，加9ml1%草酸溶液，用2，6-二氯靛酚滴定至淡红色。滴定终点要保持15秒钟。有所用2，6-二氯靛酚的体积算出1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸。 2) 样品液的滴定：准确吸取滤液两份，每份10ml，分别放入两个100ml锥形瓶中，滴定方法同上。（ 2，6-二氯靛酚用完后，请回收回原来的试剂瓶中） 五、结果计算 按下式计算100mg样品中含抗坏血酸的毫克数： m=V*T/W*100 V=滴定时所用染料ml数 T=每毫升染料氧化抗坏血酸质量 W=10ml样液相当于含样品的质量数 注意事项 1、滴定过程宜迅速，一般不超过2min。 2、