基因操作课件.pptVIP

* 整合载体：允许外源DNA插入，并在转化后整合到宿主细胞基因组中。整合是通过质粒与受体细胞中同源序列间发生的同源重组介导的。 细菌整合载体（根癌农杆菌Tｉ质粒可被用来将DNA整合到植物基因组中） 酵母整合载体： 哺乳动物整合载体：病毒为基础 * 质粒DNA的制备 质粒：是、染色体外的小型环状分子，大小2-200kb，在宿主细胞内有多个拷贝。 含有复制起点可进行自主复制；一般质粒含有几个基因，其中之一会赋予细菌对抗生素的抗性。 例如： ampr基因编码降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素的ｂ－内酰胺酶。tetA基因编码一种可以从细胞内将四环素类抗生素排除的跨膜泵蛋白。 * 技术； 质粒的制备； 酶切； 琼脂糖凝胶电泳； DNA连接； 转化； 筛选 * 质粒的小量制备： 质粒：质粒~2-20 kb 的长度远远小于大肠杆菌染色体DNA (4600 kb)，独立的超螺旋结构。 小量制备质粒： 含质粒大肠杆菌细胞的培养； 离心菌液收集菌体沉淀； 碱裂解：悬浮细胞沉淀，碱裂解，中和； 酚抽提去除蛋白杂质； 乙醇沉淀核酸。 * 碱裂解： 在缓冲液中重新悬浮细胞； 溶菌酶降解细菌细胞壁； 在裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有SDS和NaOH, SDS的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性。 NaOH的作用是使DNA变性和水解RNA。 中和缓冲液：含KAc (pH 5)，其作用是沉淀已变性的蛋白质和染色体