酶(蛋白质)工程实验-3脲酶的相对分子量测定与纯度分析课件.pptVIP

酶（蛋白质）工程实验三 ——脲酶的相对分子质量测定和纯度分析 云南大学生命科学学院生物技术专业系统实验（四） 主要内容 一、实验目的 二、基本原理 三、仪器试剂 四、实验步骤 五、结果计算 六、思考与讨论 一、实验目的 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS）的基本原理和技术方法，并学会用这种方法测定酶（蛋白质）的相对分子量和纯度。 二、基本原理 2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异、分子大小和分子形状不同之故。如果将电荷差异和分子形状等因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。 2.2 SDS与蛋白质相对分子质量测定 SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别； 此外，SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中成长椭圆形，也就消除或降低了不同蛋白质之间的分子形状。 综上所述，在SDS中，蛋白质的电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白的相对分子质量。 三、仪器试剂 3.1 设备与耗材 直流稳压电泳仪 垂直平板电泳槽 移液器（1.0ml、200μl、20μl） 微量注射器（20μl） 烧杯、试管、滴管、试剂瓶、直尺 沸水浴 3.2 试剂 30%丙烯酰胺贮备液：丙烯酰胺（Acrylamide）29g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）1g，加去离子水充分搅拌溶解并定容至100ml，4℃避光保存，30天以内使用。 分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：18.15g Tris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml去离子水，用1mol/L HCl调pH到8.8，用去离子水稀释定容至100ml，4℃保存。 浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：12.14g Tris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml去离子水，用1mol/L HCl调pH到6.8，用去离子水稀释定容至100ml，4℃保存。 10% SDS溶液：10g SDS，加约80ml去离子水充分搅拌溶解，用去离子水定容至100ml，室温保存。 5倍上样缓冲液： 0.1%溴酚蓝溶液：溴酚蓝0.1g，溶解于0.05mol/L NaOH溶液中，用水稀释至200ml，4℃保存。 10%过硫酸铵：过硫酸铵1g，用去离子水溶解并定容至10ml，临用前配制。 电极缓冲液：3g Tris，18.8g Glycine，1g SDS，用去离子水充分溶解并定容至1000ml，室温保存。 染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，用45.5ml甲醇搅拌溶解，再加入9ml冰醋酸搅拌均匀，最后加入45.5ml去离子水充分搅拌，室温保存。 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml去离子水混合。 待测酶样品：同前。 相对分子质量标准蛋白质：Fermentas （Thermo Fisher Scientific） ： 四、实验步骤 Step1：将垂直平板电用槽装好 四、实验步骤 五、结果计算 5.1 相对分子质量计算 用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心及溴酚蓝条带距分离胶顶端的距离，按照下式计算相对迁移率： 相对迁移率=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm） 以标准蛋白质Mr的对数对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。 5.2 酶的纯度分析 六、思考与讨论 6.1 思考 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶（蛋白质）相对分子质量的基本原理和技术方法。 理解酶（蛋白质）相对分子质量与实际分子质量的不同。 6.2 讨论 关于实验过程的任何认识、体会、疑问和想法……。 * * * * * 指导老师： 陈慧诚（138-8809-8105） 李彩霞（158-8782-6613） 聚丙烯酰胺的聚合反应 Step2：分离胶的选择和配制 按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同浓度的分离胶。 Step2：分离胶的选择和配制 分离胶的配制。 Step3：分离胶的灌制 根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用脲酶为待测相对分子质量和浓度的样品，用12%的分离胶。 在小烧杯中按照上表依次加入各试剂组分，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用移液器