DNA的粗提取与鉴定上课用.pptVIP

1. DNA的溶解性 （三）除去滤液中的杂质 （三）除去滤液中的杂质 讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 析出 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA 与蛋白质分开； 方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同， 使蛋白质变性，与DNA分离 2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 加入冷却的酒精溶液50ml 含DNA的滤液 析出含DNA 杂质较少的丝状物 （四） DNA的析出与鉴定 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)， 静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物。 用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水 1、DNA的析出 粗提取的DNA ? 取两支20?mL的试管，各加入浓度为2mol/L NaCl溶液5?mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热?5?min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。 加入2mol/L NaCl溶液5?mL 不加入丝状物 加入4mL的二苯胺试剂 DNA + 二苯胺 蓝色 加入2mol/L NaCl溶液5?mL 加入丝状物 加入4mL的二苯胺试剂 2. DNA的鉴定 鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。 金P58 二、DNA粗提取和鉴定的实验过程的分析 1．方法步骤 （一）实验材料的选择、 （二）破碎细胞 制备鸡血细胞液: 加入柠檬酸钠溶液， 目的是防止血凝固 书本的四大步骤，可细分为10小步骤 （三）除去滤液中的杂质 （四）DNA的析出与鉴定 搅拌：加速DNA的溶解 方法步骤 加入物质 目的 1 . 制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2 . 提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 4 . 溶解细胞核内的 DNA 2 mo1 ／ L 的 NaCI 溶液 40 mL 5 . 析出含 DNA 的黏稠物 蒸馏水 6 . 滤取含 DNA 的黏稠物 7 . 将 DNA 的黏稠物再溶解 2 mol ／ L 的 NaCl 溶液 20 mL 8 . 过滤含 DNA 的 NaC l 溶液 9 . 提取含有杂质较少的 DNA 冷却的 95 ％的酒精 50 mL A : (1) 向试管中加入 2mol/ L 的 NaCl 溶液 5 mL (2) 加入 DNA (3)4 mL 二苯胺试剂 10 . DNA 的鉴定 B : (1) 向试管中加入 2mol/ L 的 NaCl 溶液 5 mL (2)4 m L 二苯胺试剂 ①目的是防止血凝固 ②加速血细胞破裂 ④溶解DNA ⑤使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出 ⑥使含DNA的黏稠物被留在纱布上 ⑦使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中 ⑧除去含DNA的滤液中的杂质 ⑨提取DNA ⑩ A出现蓝色 B无变化 3.过滤(含核物质滤液) 1.共有“三次过滤，两次析出，六次搅拌” 2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精” 实验小结： 金P58 二、DNA粗提取和鉴定的实验过程的分析 四、操作提示 观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多； 二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功， 如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低， 或是实验操作中出现错误，需要重新制备 五、结果分析与评价 （一）是否提取出了DNA 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质 （二）分析DNA中的杂质 练习 1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。 ．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开； 最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。 2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？ 答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋