PCR教材(A)课件.pptVIP

聚合酶链反应polymerase chain reaction 南 京 农 业 大 学 陈 溥 言 复性 DNA复性：变性DNA在一定条件下恢复天然双链DNA的结构的过程。又称重退火(reannealing) （一）复性的条件 1，消除磷酸基的静电斥力； 2，破坏连内氢键 （二）复性的机制 1，随机碰撞 取决于DNA浓度、溶液温度、离子强度等 2，成核作用（nucleation) 3，拉拉链作用（zippering） 退火温度与时间 决定PCR的特异性。取决于引物的长度、碱基组成及其浓度和靶基序列的长度。在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可提高PCR反应的特异性。时间一般为30～60秒。 Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=低于Tm值-(5～10℃)　 DNA的延伸 在合适的pH和盐浓度,镁离子环境,DNA聚合酶从二个引物的3’羟基端按模板要求,利用dNTP合成新的DNA链.这个过程称DNA的延伸. 延伸温度与时间： 68～75℃（72℃），过高不利于引物和模板的结合。时间可据待扩增片段的长度而定（1Kb以内1min是足够的。3～4kb需3～4min）。对低浓度模板，延伸时间要稍长。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。 循环次数 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在5～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR一般程序 反应总体积一般为25 or 50μl (也可10μl) 循环5-40次 变性温度与时间;94-95 ℃30S-1min 复性温度与时间;40-60?C,30s-2min DNA的延伸温度与时间; 65-72℃1min,1Kb最后一次循环延伸温度与时间; 72℃10min PCR反应条件 1）模板：含靶序列的ssDNA或dsDNA 2）引物：对特异性最重要 3）DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶,种类较多. 4）dNTP：放置时间不能太长 5）缓冲液：Mg++ 6）其它：矿物油(石蜡油)、明胶、BSA 、DMSO 7）循环参数：变性、复性、延伸的温度和时间 8）循环次数 引物设计(一般用软件设计可采用“Premier Primer5”软件,而引物的评价分析则可采用“Oli go6”软件等 )原则 1.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 2.引物自身：不应存在互补序列，自身连续互补碱基3,Avoid repetitive sequence( internal hairpin structures) 3.引物之间：无互补性，尤其是3‘端。避免引物二聚体的形成。引物之间4个连续互补。 4.引物3‘端的碱基应严格要求配对：引物的3‘端是延伸的起始端。 3’ end of primer is most important: best to have G or C at end. 嵌套引物 (nested primers) 为了尽可能减少非靶序列(假产物)的扩增，最近已经发展出一种嵌套引物(nested primers)的策略。其具体的操作程序是,利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料(DNA),同时除使用第一轮的一对特异引物之外,另加一至两个同模板DNA结合位点是处在头两个引物之间的新引物。在第二轮扩增产物中,含有能够同这一组多引物杂交的错误扩增产物的可能性是极低的,所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。又称套式PCR. 测定引物的OD值 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液,取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25，说明该50微升中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。 引物几个参数 1OD引物干粉约为33微克；碱基的平均分子量为324.5；引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量； 　引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量  举例： 一管标明为2OD的20碱基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。同时请注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底