第11讲动物细胞培养生物制药III.pptVIP

第11讲 动物细胞生物制药应用 2010.11.2：世界肺炎日（第2个） 新民周刊 2010,5.17-23.P76-9 全球每年约有160万人死于肺炎链球菌 疾病，平均每38秒1名5岁下儿童死于此 病。导致儿童死亡的头号杀手，并高致 残：智力低下、癫痫（17%）、耳聋（ 27.7%）。 中国是10个肺炎发病率最高的国家之一 ，1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占 46.8%。占西太平洋区的70%。 红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达 86%。 1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗 PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的 7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世 。目前已经接种3亿剂，世界第一大单 个疫苗。 甲型H1N1流感病毒：2009年4 月墨西哥猪流感造成数150多 死亡事件，并在多个国家蔓延。 H5N1禽流感：2011年仍有爆发。 SARS病毒：2003年全世界性的 事件。 HIV病毒：艾滋病。 2009年12月3日，国家食品药 品监督管理局发现，江苏延申 和河北福尔生物制药股份有限 公司的7个批次人用狂犬病疫 苗存在质量问题。 2010年3月17山西疫苗事件 本节主要内容 1.杂交瘤技术生产单克隆抗体 2.病毒疫苗生产 本节关键问题 杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程 一 杂交瘤技术生产单克隆抗体 问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？ 细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两 个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传 重组，在育种方面意义重大。 杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。 基础知识回顾 （一）免疫学基础 1抗原 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作 用的外源物质。 包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、 各种细胞等。 特点：外源性、结构性（分子表面具有 稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异 性（抗原与抗体的反应）。 2抗体 动物免疫系统分泌的中和或消除 抗原物质的影响的物质，存在于 血清中，本质是免疫球蛋白 （Immuniglobulin,Ig）。 互补性决定区（Complementarity determining region，CDR） VH 和VL的三个高变区共同组成Ig的 抗原结合部位（Antigen-binding site）。该部位形成一个与抗原 决定簇互补的表面，决定抗体的 多样性与特异性。 多克隆抗体与单克隆抗体 动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞 就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决 定族产生的抗体是单克隆抗体。 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族， 因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克 隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原 决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗 体。 问题的引出 血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅 针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不 可能的，因此必须采用其他方法。 如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的 B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？ 问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？ 很难离体培养B淋巴细胞。 （一）历史发现 1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适 应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与免 疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融 合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像 骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增 殖，又能持续地分泌特异性抗体。 （二）杂交瘤技术 将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够 分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过 克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞， 这种技术通称为杂交瘤技术（hydridoma technique）。 （三）单克隆抗体应用领域 单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物 活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于 生物学和医学研究领域： 1.作为亲合层析的配体 2.作为生物治疗的导向武器 3.作为免疫抑制剂 4.探针 5 .增强抗原的免疫原性 6. 作为医学检验试剂 1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔 内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗 体）三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最 后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬 液。 2.骨髓瘤细胞的获得与培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样 杂交融合率高。 通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶） 与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞 系。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细 胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3.细胞融合 （1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清， 用不完全培养液混悬细胞后计数，取