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酵母醇脱氢酶的提取及 专一性测定 一、实验目的 掌握醇脱氢酶的提纯的原理和方法。 二、实验原理 以酵母为原理,利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白等方法,提取具有一定纯度的醇脱氢酶,注意每一步提纯均需测定蛋白含量及酶活力。 醇脱氢酶的辅酶NAD (过量)CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO+NADH+H+ 当醇过量时,NAD+被还原速度与酶活力成正比,酶活力愈高,单位时间产生的NADH愈多,后者对340nm有较强吸收;通过测定NADH含量,得知酶活力大小。 三、实验器材 37℃,55℃水浴 紫外-可见光分光光度计 ,石英比色皿 冰浴 离心机 ,离心管 透析袋(截留分子量5000-10000Da) 四、实验试剂 1. 酵母 2. 3M 乙醇 3. 0.06M 焦磷酸钠(pH 8.5) 4.0.0015M NAD 5.0.01M K2HPO4 6. 丙酮 (预冷) 7. 0.066M Na2HPO4 五、实验步骤 (一)提纯酵母醇脱氢酶 1. 粗提 取20g干酵母于250ml烧杯中,加80ml 0.066M Na2HPO4,37℃保温2小时,不断搅拌,室温再提取3小时,4000rpm,离心20min,量取上清液V1,留2ml上清测蛋白含量及酶活力。 2. 热变性去杂蛋白 将剩余上清55℃加热15-20min,不断搅拌,冷水冷却后,4000rpm,离心20min,得上清液V2,,留2ml上清测蛋白含量及酶活力。 3. 有机溶剂沉淀杂蛋白 将上清置于盐冰浴中,加入50%上清体积的预冷丙酮,边加边搅拌,放片刻,0℃,4000rpm,离心5-10min,留2ml上清测蛋白含量及酶活力,其余上清置于盐冰浴中。 4. 有机溶剂沉淀酶蛋白 将其余上清中逐滴加入11/22上清体积的预冷丙酮,待沉淀完全后,0℃,4000rpm,离心15min。弃上清,将沉淀溶于少许蒸馏水中,转移至透析袋中,对冷水透析3h(冰箱中),离心去沉淀,上清即达到一定纯度的醇脱氢酶制剂。 五、实验步骤 (二)蛋白浓度测定 (Folin-酚法或紫外吸收法测定) 将前面四步所留取得上清,分别用少许蒸馏水稀释100-200倍后,测浓度。 (三)酶活力测定 1. 将前面四步所留取得上清用0.01M K2HPO4稀释如下: 第一步上清稀释5倍; 第二、三、四步各稀释10倍。 2. 准备试管5只,编号1-5,加入以下四种试剂: 3. 再向试管1中加入1ml蒸馏水;试管2-5中分别加入1ml K2HPO4稀释后的上清,混匀后,以第一支试管为空白,立即测A340nm。每隔15s测一次,直到A340nm不变。(注意,2-5号管可按照一支一支的测)。以每分钟A340nm增加0.001为1个活力单位。 3M 乙醇 0.1ml 0.06M 焦磷酸钠 0.5ml 0.0015M NAD 0.1ml 蒸馏水 2.2ml 五、实验步骤 (四)结果 (按照测定的数据完成下表) C= A×B E=A×D F= D/B
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