第19章基因诊断(阅读).pptVIP

斑点杂交结果： βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS DNA芯片技术的应用领域 基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将待测分析的PCR扩增产物进行电泳，到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时，DNA双链分开，由于不同DNA片段的碱基组成不同，因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以将相同长度但碱基组成不同的DNA片段分开，从而能检测出基因的突变。 6、采用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术 DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。 如在一般正常的细胞中，基因调控区CPG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态。因此DNA甲基化研究是一热点。 7、甲基化特异性PCR技术 将DNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（primerⅠ），一对为非甲基化的引物（primerⅡ），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究DNA片段部位的甲基化情况。 甲基化特异性PCR技术（ MS-PCR ） 以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基因诊断技术，只能提供定性结果，即有无突变。但对基因表达异常的疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基因的表达量上的变化分析，故还可运用PCR定量分析基因表达。 PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀释法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法 、 荧光定量PCR 8、采用PCR技术进行靶核酸的定量分析 PCR扩增有限性-平台期及平台 效应（plateau effect） PCR扩增的平台效应 梯度（系列）稀释法： 在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA） 如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量 必须在扩增的指数期进行 优点：简单，可作粗糙的定量分析。 缺点：不准确，影响因素多。 首先将原始模板进行梯度稀释; 然后对该稀释系列进行PCR扩增测定; 最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模板 基本依据：PCR扩增的有效起始模板分子数为104～106个 改良方法：极限稀释分析 非竞争性对照基因定量法 该定量法是靶基因与参照基因的同步扩增。即在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)。通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量。 靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。 竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。 将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量的样品DNA进行PCR，通过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析。 竞争性PCR： 3. DNA sequencing DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术 例：四色荧光自动测序分析结果 4.DNA芯片技术DNA chips or microarray 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术 DNA芯片技术的概念 DNA芯片技术原理 大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息 生物战剂检测 临床疾病的 基因诊断 法医学鉴定 药物研究开发 动植物检疫 基因组研究