L-天门冬酰胺酶方案.pptVIP

班级：14制药3 姓名：潘攀 学号：1401020329 L-天冬酰胺酶的基本介绍 L- 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，它在血液中特异性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨使某些肿瘤细胞因摄取不到足够的L-天冬酰胺而导致细胞增殖受到抑制，从而达到抗肿瘤目的，临床上用于治疗南急性淋巴细胞白血病等，是一种重要的抗肿瘤药物。 L- 天冬酰胺酶的分子结构 1922年Clement发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mash burn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚和甲醇，水溶液20℃储存7d，5℃储存14d均不减少酶的活力。干品50℃ 15min酶活力降低30％，60℃ 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37℃。 目前最常用制备L-天冬酰胺酶的方法是用大肠杆菌备。 右图是大肠杆菌形态图 工艺路线 大肠杆菌发酵生产工艺 （1）工艺路线菌种培养 菌种培养 种子培养 营养肉汤培养基 玉米浆 大肠杆菌 → 肉汤菌种 → 种子液 37℃.4~8h 37℃.6~8h 发酵罐培养 压滤、风干 提取 玉米浆 丙酮 硼酸缓冲液 → 发酵液 → 干菌体 → 提 沉淀 热处理 HAC 甘氨酸 取液 → 粗酶 → 酶溶液 PH4.2~4.4 60℃.，30min 精制聚乙二醇 → 无热原酶液 → 冻干 → L-天冬酰胺酶 1菌种培养采用大肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g 37℃,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。 2 种子培养培养基用玉米浆30kg，加水至300kg，接种量1%-1。5%，37℃，通气搅拌培养4-8h. 3 发酵罐培养 取玉米浆100Kg，接种量8%，37℃，通气搅拌培养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。 4、 提取、沉淀、热处理 每千克菌体干粉家兔0.01mol/L pH8的硼酸缓冲液10L，37℃保温搅拌1.5h，降温到30 ℃，用5mol/L醋酸调pH4.4~4.4，压滤，滤液中加入2倍体积的丙酮，放置3~4h，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。 取粗制酶1g,jiaru 0.3/%甘氨酸溶液20ml，调节PH8.8，搅拌1.5h，离心收集上清，加热到60℃维持30min进行热处理。离心弃去沉淀，上清液加2倍体积的丙酮，析出沉淀后离心，收集酶沉淀，用0.01mol/L、pH8磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。 5精制、冻干 上述酶溶液调PH8.8，离心弃去沉淀，清夜再调PH7.7，加入5