沉默idl基因表达对食道癌细胞Eca解剖.pptVIP

沉默idl基因表达对食道 癌细胞Eca-109生物学行为的影响 小组成员：王丽、汪霖、王金华、许双双、蒋爱军、李彩红、杨欢、张小虎 研究背景 实验原理 实验材料 实验内容与步骤 实验结果 讨论 食道癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率列肿瘤第六位，目前对食道癌的治疗多采用手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗措施。但是，由于食道癌的耐药性，5年的存活率仅为11.7，因此研究一种技能提高肿瘤效果同时毒性又低的方法具有重要意义。 当前，基因治疗是非常有前途的研究方向，RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是基因治疗研究的热点，RNAi的特异性及高效性使其可能成为前景光明的治疗方案。 分化抑制因子(Id)蛋白是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子的负调控蛋白，具有抑制细胞分化的作用。其中，又以Id1蛋白的研究最为广泛。 本研究采用DNA重组技术构建针对idl的短发卡RNA(shRNA)表达载体，观察其对idl表达抑制作用，研究idl基因沉默后对Eca一109细胞生长、增殖产生的影响，探索食道癌治疗的新方法。 实验材料 pGFU6／neo载体(上海吉玛公司) LipofactamineTM 2000试剂盒(Invitrogen公司)； 各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶(TaKaRa公 司)； 总RNA提取试剂盒(BioBasic公司)； RT-PCR 试剂盒(TaKaRa公司)； Idl、p16、增殖细胞核抗原 (PCNA)和β-actin抗体(Santa Cruz公司)； 羊抗兔 二抗(北京中杉产品)。 食道癌细胞株Eca-109由教研室保存提供。 实验步骤 ⒈ shRNA序列设计与重组质粒的构建 ⒉食道癌细胞Eca一1O9的分组及转染 ⒊RT-pCR检测idl tuRNA含量 ⒋细胞生长曲线测定 ⒌克隆形成检测细胞增殖 ⒍流式细胞术检测细胞增殖和周期分布 ⒎Western blot检测Idl、pl6、PCNA蛋白 表达 8.统计学方法 shRNA序列设计与重组质粒的构建 根据 GenBank中报道的idl的cDNA序列 ，参考Ambion公司小分子干扰RNA (siRNA)设计原则和在线设计分析,分别设计两对可干扰序列。 模板链退火 后被克隆至pGFU6／neo载体中，分别命名为 pGFU6／neo～idl一1、pGFU6／neo—idl一2和pGFU6／ neo—NC。 其中，pGFU6／neo—NC为通用对照质粒。 重组质粒送吉玛公司酶切(BarnH I和Bbs I)和测 序鉴定。 食道癌细胞Eca一1O9的分组及转染 Eca一 109细胞复苏、培养增至70%汇合时，按 LipofectamineTM 2000脂质体转染说明书进行转染， 48 h后600 μg／mL G418进行筛选，两周后出现单 克隆，用克隆环法挑取，用400~μg／mL浓度G418维 持。实验共分为3组： RT-pCR检测idl tuRNA含量 根据idl 基因序列，设计其特异性引物： 上游引物5 -CTGTTCCATTTTCCGTATC TGC一3 ， 下游引物5 r_GCTCCTTGAGGCGTGA GTAA一3 ，产物大小为318 bp；内参B—actin引物： 上游引物5，-GCGGGAAATCGTGCGTGA(、-3 ， 下游引物5，_ATGCCCAGGAAGGAAGGCT一3 ，产物 大小为191 bp。 将各组细胞按Trizol操作说明书提取总RNA，按RT—PCR试剂盒说明书检测idl mRNA含量 取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶系统成像。密度扫描半定量分析，根据相应 条带灰度值计算抑制率。 细胞生长曲线测定 克隆形成检测细胞增殖 分别接种500个 实验组和对照组细胞于每一平皿(60 ram)中，培养 1O～14 d后，经40 μg／L多聚甲醛固定，2 Giemsa 染色，低倍镜下计数100个细胞的克隆。 流式细胞术检测细胞增殖和周期分布 Western blot检测Idl、pl6、PCNA蛋白表达 分别收集实验组和对照组细胞，提取细胞总蛋 白，BCA法定量。 统计学方法 数据用χ±S表示采用单因 素方差分析和t检验，P0.05为差异具有统计学意义。 实验结果 1.重组质粒的酶切鉴定及序列测定 3组质粒pGFU6／neo—idl一1、pGFU6／neo—idl一 2、pOFU6／neo—NC经测序，结果显示与设计DNA 片段完全一致，符合设计要求。 2.RT-PCR分析idl mRNA的表达 结果显示；pGFU6／neo-idl