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第三章 细胞生物学的研究方法 第一节 显微镜技术 （一）普通光学显微镜（Light Microscope） 组成 （1）光学放大系统（目镜和物镜） （2）照明系统（光源、折光镜、聚光镜、滤光片） （3）机械和支架系统 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率（resolution）。 显微镜的分辨率是由物镜决定的。 显微镜的几个光学特点： 通常2?最大值可达140°， sin?的最大值必然小于1；介质为空气中N=1 ；油镜头用香柏油为介质，N=1.515 普通光线的波长为白光500nm，因此，普通光镜的最大分辨率约为0.2μm，人眼的分辨力约为0.1mm,因此显微镜的最大设计倍数约为500×。 （二）荧光显微镜（Fluorescence Microscope） 荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 荧光显微镜用于研究 细胞内物质的吸收、 运输、化学物质的分布 及定位等。 1-滤光片甲：仅让波长在450nm和490nm之间的紫外线通过 2-光束分离镜：反射波长510nm的光束，波长510nm的光束可通过 3-滤光片乙：滤掉多余的荧光信号，让520nm－560nm之间的绿荧光信号通过 （三）相差显微镜（Phase-contrast Microscope） 通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快 二、电子显微镜技术 以波长比可见光短得多的电子束作为光源，用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图像用荧光屏（感光胶片）来显示（记录）； 分辨率可达0.2nm，有效放大倍数为106倍； 结构： （1）电子束照明系统（电子枪、聚光镜） （2）成像系统（物镜、中间镜、投影镜） （3）真空系统（两极真空泵） （4）观察记录系统 透射电子显微镜标本制备 由于电子束穿透能力有限，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05?m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。 超薄切片技术 为便于电子穿透，获得高分辨率，需将样品切成极薄的薄片，即超薄切片技术（ultrathin section）。 （二）扫描电子显微镜 扫描电子显微镜（scanning electron microscope）是用来观察样品的表面形态结构。 基本原理是用电子枪发射的电子束，激发样品表面放出二次电子，再由探测器收集并向电子显象管传送信号。二次电子产生的多少与样品表面形貌有关，从而形成图像的明暗差别，得到放大的立体图像。 样品经固定脱水后，需喷涂一层重金属微粒。 第二节 细胞的分离和培养 流式细胞技术 流式细胞仪 (flowcytometer,FCM) （荧光激活细胞分选仪） 对细胞进行自动分析和分选的装置 结构： 液流系统 激发光器件 信号检测 控制系统 应用： 细胞分选: 1cell in 1000 2w-5w cells/sec 流式细胞术（flow cytometry）：可对单个细胞进行快速定量分析与分选。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。 Annexin?V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡 制备细胞匀浆 细胞 匀浆液 离心技术 P44 离心机是借离心力分离液相非均一体系的设备。 根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为离心。 微粒在重力场下移动的速度 与微粒的大小、形态和密度 有关，并且又与重力场的强 度及液体的粘度有关。 离心是研究亚细胞成分和生物大分子的基本手段，低速离心（8000rpm）可将细胞器（细胞核、线粒体、高尔基体等）从细胞匀浆后悬液中分离出来。 转速为10~25krpm的离心机称为高速离心机。 转速25krpm的离心机称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达85krpm，离心力超过600,000g。 （一）差速离心 差速离心（differential centrifugation）利用不同离心速度产生的不同离心力，将沉降系数不同的各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 用于分离大小、形状显著不同的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离. 特点： （1）介质密度均一； （2）速度由低向高