台盼蓝拒染法、MTT法、CCK―8法在研究As2O3细胞毒性作用中的意义.docVIP

台盼蓝拒染法、MTT法、CCK―8法在研究As2O3细胞毒性作用中的意义 　　[摘要] 目的 筛选三氧化二砷（As2O3）对HL-60细胞毒性的有效剂量及作用时间的检测方法，并对其结果进行分析。 方法 采用台盼蓝拒染法、MTT法、CCK-8法测定不同浓度的As2O3体外作用HL-60细胞株的细胞存活率，采用单因素方差分析其与剂量-时间依赖反应的关系。 结果 4.0、8.0 μmol/L作用48、72 h及8.0 μmol/L作用24 h被染细胞小于5%，其余均未观察到蓝染细胞。MTT法检测在1.0～8.0 μmol/L As2O3剂量范围内培养24、48、72 h（P 0.05），各组均能够抑制HL-60细胞活性。CCK-8法检测在0.5～8.0 μmol/L As2O3剂量范围内培养24、48、72 h（P 0.05），各组均能够抑制HL-60细胞活性。HL-60细胞在不同时间、不同浓度均能出现细胞存活率明显降低，As2O3的毒副作用呈现明显的剂量-时间依赖反应。 结论 在研究As2O3的细胞毒性时，用CCK-8法优于MTT法，均比台盼蓝法更为灵敏。 　　[关键词] 台盼蓝拒染法；MTT法；CCK-8法；三氧化二砷；HL-60；线粒体 　　[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0024-03 　　砷剂用于肿瘤的治疗已有几百年的历史，近年我国学者在临床实践中发现三氧化二砷（As2O3）可用于白血病，尤其是急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的治疗，可以获得良好的治疗效果[1]。As2O3不仅使初治的APL患者缓解率增高，而且对于全反式维甲酸和化疗耐受的复发患者及其他类型的白血病患者治疗效果好。现已被广泛应用于白血病和其他实体瘤的研究[2-3]，但是其致癌、致畸的毒副作用限制了其在临床的应用。有研究表明As2O3的毒性呈剂量依赖性[4]，在进行As2O3细胞生物学效应及临床应用范围的科研中，常规先要进行其细胞毒性研究。现代实验研究在利用体外培养技术进行检测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性的研究时，需要依据受试药物对细胞存活率的测定结果确定其他研究的适合剂量和应用时间。目前，已介绍的常用的实验方法有台盼蓝拒染法、噻唑蓝（MTT）比色法和CCK-8法。为了筛选检测As2O3细胞毒性作用浓度的方法，本次研究分别采用台盼蓝拒染法、MTT比色法和CCK-8法进行实验研究，并对这三种实验方法做出了比较。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株 人急性髓系白血病细胞株HL-60由本实验室冻存。HL-60细胞常规培养于10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养液中，其中青霉素、链霉素浓度均为100 U/mL，培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度，2～3 d换液传代一次。 　　1.1.2 药物及试剂 As2O3、台盼蓝、MTT、DMSO购自美国Sigma公司，CCK-8购自晶美公司，新生牛血清、RPMI-1640完全培养液购自TBD。 　　1.2 方法 　　1.2.1 台盼蓝拒染法 取对数生长期的HL-60细胞用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×105/mL的单个细胞悬液接种于24孔板内，按照实验设计加入含不同浓度的As2O3培养液1 mL，以只加培养液不加细胞作为空白对照组。每组设3个平行孔。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养24、48、72 h后收集细胞，经0.4%台盼蓝染色后，显微镜下拍照后计数活细胞，并根据以下公式统计细胞活率：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。 　　1.2.2 MTT法 取对数生长期HL-60细胞接种于96孔板，每孔180 μL，每孔含1×104个细胞，常规培养24 h。加入含实验所需不同浓度的As2O3培养液。另设空白组、对照组加入相应体积的溶剂。使每孔终体积达200 μL。每组设6个平行复孔。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养20、44、68 h后，加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h。于24、48、72 h后终止培养，离心去上清后加入DMSO 150 μL，摇床轻微振荡10 min，酶标仪选择570 nm波长检测，测定吸光度值A。并根据以下公式统计细胞活率：活细胞率（%）=（实验组A值/对照组A值）×100%。 　　1.2.3 CCK-8法 取对数生长期HL-60细胞接种于96孔板，每孔含1×104个细胞，常规培养24 h。加入含实验所需不同浓度的As2O3培养液，另设空白组、对照组加入100 uL的溶剂。每组设5个平行复孔。加药后分别培养24、48、72 h，