肝素钠测定数据以及标准曲线.docVIP

肝素钠的提取与检测 摘要 本实验主要是对肝素钠提取工艺的研究。对国内外肝素钠的提取和纯化方法进行研究和分析，建立以牛内脏（肝、肺、心）为原料，采用盐解、离子交换的方式与乙醇沉淀相结合提取肝素钠。利用天青A染色法检测肝素钠的效价，测定波长是505nm，与标准曲线对比可得到样品中肝素钠的效价。利用浓硫酸氧化法，在波长为298nm处的吸光度来确定肝素钠的浓度。利用双缩脲法，在波长为540nm处的吸光度来确定蛋白质的含量。试验测得肝素钠的效价平均值为139.483U/mg，肝素钠的浓度平均值为200.8752mg/kg，去除蛋白质效果良好，均在99%以上。 关键词：肝素钠，盐解，树脂，天青A，纯化，蛋白质 1.1研究背景和意义 1.1.1研究背景 肝素钠又称肝素，是重要的生物药品，作为天然的抗凝血物质而受到世界各国的重视。我国是世界上肝素钠主要出口国之一，但是出口产品以低效价的粗品肝素为主。肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在[1]。这种复合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种活性逐渐表现出来。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。中国具有丰富的畜产品副产物资源，但我国生产的肝素产品效价低，提取率低的问题很突出，这种情况下，只有提出肝素提取纯化新工艺，才能提高畜产品加工副产物的附加值，拓宽利用领域，增加国民收入，提高中国在国际上的地位。 1.1.2研究意义 肝素主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠粘膜细胞内。目前，国内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主，在提取工艺中都必须经过肝素蛋白质复合物的提取、肝素蛋白质复合物的分解和粗品肝素的精制三个过程。 国内每年猪牛屠宰量极大，副产物产量极高，但是目前利用率却很低。其主要原因是加工技术和装备水平落后，产品提纯方面的产业化技术还没有真正突破。 1.1.3肝素效价显色原理 肝素是一种粘多糖，在多糖链上带有很多阴离子基团，如磺酸基、羧基等。因而肝素具有很强的负电性，能与阳离子或带正电荷的分子结合，生成复合物。天青A染料是一种碱性染料，即正电荷部分能与肝素的阴离子结合，生成肝素天青复合物，并能表现因光异色现象，即产生一种较原来染料颜色不同的反应，这一反应程度与肝素结合量有一定关系。1976年，杰奎斯等在贝克曼DK-2分光光度计上利用天青A作肝素定量测定，发现低浓度肝素在波长505nm，pH=8.6的条件下，肝素浓度与吸光值之间符合朗白---比尔定律。该法可用于测定肝素效价和生产过程的控制。 2实验材料与方法 2.1实验材料 2.1.1试剂和材料 牛内脏 秦宝 肝素标准品 中国药物生物检定所（北京） 氯化钠 上海恒远生物科技有限公司 乙醇（95%） 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司 巴比妥 分析纯 西安化学试剂厂 天青A染料 生物染色剂 天津市天新精细化工开发中心 氢氧化钠 分析纯 天津市大茂化学试剂厂 硫酸 分析纯 白银化学试剂厂 硼砂 分析纯 上海易利生物科技有限公司 陶氏AMBERLITETMFPA98CL食品级特种聚合物（树脂） 上海唯高实业有限公司 2.1.2实验设备 JJ—2B组织捣碎匀浆机 金坛市医疗仪器厂 PH-3C计 上海佑科仪器仪表有限公司 85-2恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司 电热恒温热水槽 HH-S8型北京科伟永兴仪器有限公司 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 100目筛 浙江上虞市水仙纱筛厂 电磁炉 广东美的生活用品制造厂 真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司 真空抽滤机 郑州长城科工贸有限公司 756P紫外—可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司 电子天平 慈溪市天东衡器厂 填充柱 2.2实验方法 原料——提取——吸附——洗涤——洗脱——沉淀——脱水干燥——肝素钠粗品——提纯——肝素钠。 2.2.1具体操作控制 (1)提取[2,3] 取牛肺样品100g，加入5倍量的蒸馏水，在组织捣碎机中充分破碎至肉糜状，用NaOH溶液调ph至8.5，加入5%NaCL在60℃下不时搅拌2h，立即升温至100℃10min沉淀蛋白质，用100目的筛过滤，滤液备用。 (2)吸附 滤液冷却至50℃