Ghrelin对大鼠心肌梗死后血管重构的影响及机制研究.docVIP

Ghrelin对大鼠心肌梗死后血管重构的影响及机制研究 　　[摘要] 目的 研究Ghrelin在心肌梗死（MI）后大鼠心肌血管重构中的作用及其可能的机制。 方法 成年SD雄性大鼠通过结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型，假手术组开胸后剪开心包腔，但不结扎左前降支。心肌梗死Ghrelin组大鼠皮下注射Ghrelin，2次/d，剂量为100 μg/kg；心肌梗死盐水组皮下注射等量的生理盐水，观察4周。利用RT-PCR法检测VEGF mRNA表达，利用蛋白质印迹（Western-blot）法检测各组动物VEGF蛋白的表达，免疫组化法分析新生血管的密度。 结果 心肌梗死盐水组与心肌梗死Ghrelin组24 h内死亡情况分别为18.0%比16.0%（P 0.05）。术后存活24 h的45只动物进行Kaplan-Meier生存分析显示，心肌梗死盐水组和心肌梗死Ghrelin组28 d生存率为66.1%比81.2%（P 0.05）。与心肌梗死盐水组相比，Ghrelin显著增加梗死边缘区VEGF mRNA（0.65±0.05比0.35±0.03，P 0.05）及VEGF蛋白表达水平（0.75±0.04比0.50±0.03，P 0.05）。与心肌梗死盐水组相比，Ghrelin能显著增加血管α-平滑肌肌动蛋白在心肌梗死部位密度[（6.0±2.1）/mm2比（4.0±1.8）/mm2，P 0.05）和在梗死边缘区密度[（25.0±9.5）/mm2比（15.0±5.7） /mm2，P 0.05）。 结论 Ghrelin可通过增加的VEGF表达促进血管生成，从而改善心功能、防止心脏重塑。Ghrelin可望作为心肌梗死后抑制左室重塑一种新的对策。 　　[关键词] 心肌梗死；心室重构；血管重构；Ghrelin 　　[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（a）-0004-04 　　心肌梗死（MI）后心室主要重构过程包含心室扩张、纤维化，最终导致心功能异常。有疗效的诱导血管再生对于MI后的慢性心肌缺血和相关的重塑是一种很有前景的治疗方法[1]。血管内皮生长因子（VEGF）是血管生成的一个重要引发剂[2]。Ghrelin是从人类和大鼠胃里分离出的一个28-氨基酸多肽，并在1999年认定为一个GHS-R1A型的内源性配体，这已被证明作用在心脏和血管里[3-4]。人工培养的心肌细胞能够合成Ghrelin。Ghrelin除对心血管系统有保护作用外，Ghrelin及其受体在人类微血管内皮细胞（HMVEC）中有表达，并且Ghrelin通过ERK2信号的激活，刺激HMVEC的增殖、迁移和血管生成[5]。另外，Ghrelin表达量的减少是血管生成后老化相关损害的影响因素之一[6]。目前，Ghrelin是否能促进心肌梗死后的活体动物模型心肌血管生成及其可能的机制仍未明确。因此，本研究旨在通过建立心肌梗死大鼠模型，研究Ghrelin对心肌血管在成的影响，并试图阐明其相关的机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂与仪器 　　Ghrelin购自美国Alexis公司；日本Bioer定量PCR检测系统；S-P免疫组化染色试剂盒购自于深圳晶美生物科技公司；DBA显示试剂盒购自于深圳晶美生物科技公司；抗兔多克隆抗体及化学发光工具包购自于碧云天生物技术研究所；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）购自于武汉博士德公司。 　　1.2 动物模型制作及分组 　　清洁级健康雄性SD大鼠，10周龄，体重为200～250 g购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔给药麻醉动物后气管插管，连接小动物呼吸机，然后暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间结扎冠脉前降支制成心肌梗死（MI）模型。纳入实验的雄性SD大鼠65只，随机分为假手术组（15只），心肌梗死盐水组（25只），心肌梗死Ghrelin组（25只）。 　　1.3 药物干预 　　在MI模型成功建立后第7天，开始药物干预。心肌梗死Ghrelin组大鼠按100 μg/kg皮下注射大鼠Ghrelin，每天两次，假手术组及心肌梗死盐水组在相应部位注射生理盐水，给药时间为4周。 　　1.4 实时定量PCR（RT-PCR）方法检测VEGF mRNA表达 　　取梗死边缘区左室心肌组织100～150 g，加入l mL Trizol，冰上匀浆，提取总RNA，并合成cDNA。所有引物均参照GenBank提供的序列，用Primer 5.0设计，由上海生物工程公司合成。引物序列如下：VEGF（15 bp）：上游5′-GGGATGATGACGACCTGC-3′，下游5′CCACTTGTTGGCTTATGTT-3′；GAPD（10 bp）：上游5′