免疫诊断..pptVIP

免 疫 诊 断 第一节 抗原或抗体的检测 一、原理： 物质基础： 抗原的表位与抗体的高变区分子间结构互补性与亲和性。 反应的阶段性： ◆特异性结合阶段 ◆可见反应阶段 ㈠特异性： ㈡比例性： ㈢可逆性： 抗原－抗体 非共价建 (二)抗原或抗体的检测方法： 1.凝集反应： 颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在有电解质存在时，比例适当，形成肉眼可见的凝集团块。 （1）直接凝集： 玻片法：定性检测未知抗原 如ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：定量检测未知抗体 如肥达氏反应 （2）间接凝集：载体颗粒（RBC、乳胶等） 间接凝集：包被已知抗原，如Coombs test 反向间接凝集：包被已知抗体 间接凝集抑制反应：妊娠乳胶试验(HCG) 2.沉淀反应： 可溶性抗原（血清蛋白、细胞裂解液等）与相应抗体结合后，在有电解质存在时，比例适当，出现肉眼可见的沉淀物。 半固体琼脂凝胶为介质。 原理: 检测抗原 （2）双向免疫扩散： (3)对流免疫电泳： （4）免疫电泳 原理：电泳后双扩 3.免疫标记技术： 标记物：荧光素、酶、放射性核素等 特点：敏感性高，定性、定位、定量 （1）免疫荧光法： FITC、PE （2）酶免疫测定：HRP、AP *酶免疫组化法： 测定组织中或细胞表面抗原 *酶联免疫吸附试验（ELISA）： 测定可溶性抗原或抗体 ELISA原理： 将已知抗原或抗体吸附于固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤液将游离成分洗去。 方法： *双抗体夹心法： 检测抗原 *间接法： 检测抗体 （3）放射免疫测定法（RIA）： 131I、125I标记，微量物质测定 第二节 淋巴细胞的测定 外周血单个核细胞（PBMC）分离： 密度梯度分离法 淋巴细胞亚群的分离与鉴定： 尼龙毛分离法： E花结实验： 流式细胞术： Lc功能测定： 1.淋巴细胞增殖/转化试验： 原理： 有丝分裂原等非特异刺激T、B细胞向淋巴母细胞转化、增殖。 方法： MTT法： 2. T细胞介导的细胞毒试验：CTL 3. B细胞溶血空斑实验： * * P241 前带 后带 等价带 二、抗原抗体反应的特点： 凝集 沉淀 标记技术 直接凝集反应 已知 标本 ⑴单向免疫扩散： Ab+琼脂 制板 打孔 Ag NS Ag Ag 加样 观察 （含量） 沉淀环 Ag扩散 Ab固定于琼脂 单向免疫扩散 琼脂 Ab NS 方法和原理： 双扩＋电泳 NS Ag Ab 应用：血清蛋白种类分析 应用： 检测CD分子；传染病和自身免疫病诊断。 FITC标记 Ag 底物 包被 标本 洗涤 酶标抗体 洗涤 洗涤 洗涤 标本 观察结果 *生物素-亲和素系统（BAS）ELISA： 生物素标记抗体，酶标记亲和素 *抗原竞争抑制法： 标本 或放射 自显影 （4）免疫印迹Western Blot 覆盖转印→硝酸纤维素膜 （去垢剂） 将分子大小不同的蛋白质分开 41 24 120 稀释的抗凝血 淋巴细 胞分离液 淋巴细胞分离液 血浆 血小板 PBMC 红细胞 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞90% CD2/LFA-2 利用表面标志分离淋巴细胞亚群 免疫荧光 样品进入孔 待分离单细胞悬液 ＋荧光标记抗体 产生散射光 光电倍增管 发射荧光 根据细胞表面电荷 线粒体琥珀脱氢酶 MTT （噻唑盐） 甲臜颗粒 （紫蓝色） 氚标记的胸腺嘧啶核苷 放射能 丝裂原 淋巴细胞增殖实验 3H-TdR掺入法 MTT 用酶标仪 测定细胞 培养OD值 待检 杀伤 靶细胞 标记