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3、PCR诱变 （1）四引物法 (重组PCR：Recombinant PCR) R. Higuchi等人首创，突变反应需要四个引物，共进行三轮反应 ① 头两轮反应应用两个互补的、并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，且重叠区内有同样突变 ② 去除未掺入多余引物，将两对双链DNA片段变性，退火，形成两种不同形式的异源双链分子 ③ 具有3′-凹陷末端的双链分子在Taq DNA Pol.作用下生成目标突变体 PCR反应分开做！ 试管1 试管2 （2）三引物诱变法 (大引物诱变法，Megaprimer method of mutagenesis) 以第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的大引物，简化反应步骤，获得突变DNA的方法 （3）两引物PCR定向诱变法 Exsite TM PCR-Based Mutagenesis 突变反应仅需两个引物，突变位点设置于一个引物末端，使用高效的 Pfu DNA Pol. 进行高温长片段DNA PCR扩增，可定向地引入碱基替代，缺失和插入定向突变 替代突变 缺失突变 插入突变 主要参考文献 [1] Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463 [2] Maxam, A.M.W. Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:560 [3] Maxam, A.M., 1980, Methods Enzymol., 65:499 [4] Chen, G.Y. P.H. Seeburg，1985, DNA, 4:15 [5] 邓炜，1995， 生命的化学， 15（6）：34-36 [6] 沈孝宙，1992，生物工程进展， 12（3）：1-6 [7] 程介克，1995，生物化学与生物物理进展， 22（3）：223-227 [8] 米志勇，1996， 生物工程进展, 16（30）；54-56 复习思考题 ● 试举例说明近年来PCR的技术进步及其应用情况。 ● 有几种方法可以实现基因定点突变？简述其原理及操作程序。 * * AY840588 T. ver* 4490 T. ver* AY504663 T. ver 4281 T. ver* AY840581 T. ver* AY840586 T. ver* AY309018 T. ver AY840577 T. ver* AY309019 T. ver AY309015 T. ver AY686706 T. ver AY840587 T. ver* AY309016 T. ver AY309017 T. ver AY840574 T. ver* AY840585 T. ver* AY840575 T. ver* AY840584 T. ver* AY840579 T. hir* AY840589 T. ver* AY840576 T. ver* AY805633 T. ver AY840578 T. pub* AF516556 T. hir 4267 T. hir* 5241 T. hir* AY840572 T. pub* AY840566 T. pub* 4297 T. hir* AY840565 T. pub* AY840571 T. ver* AY840567 T. pub* AY840568 T. hir* AB158315 T. max AY840570 T. pub* AJ006670 S. del AY849307 S. pac AJ438139 T. tro AY636059 G. luc AJ627584 G. phi AJ608713 G. phi AF516599 P. tub 100 100 100 97 99 69 65 97 55 55 81 90 AY840583 T. ver* 用邻接法分析ITS序列距离构建系统发育树。 Polyporus tuber
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