5.鸡血细胞融合1课件.pptVIP

实验五 鸡血细胞 的体外融合 一、实验目的 1. 熟悉细胞融合的理论 2. 掌握PEG诱导的细胞融合方法 二、实验原理 利用PEG介导的细胞融合，其融合效果  受以下因素影响： PEG的分子量与浓度：D=4000、50％ PEG的处理时间：2－5分钟 融合时的温度：37－40度 PEG的 pH值：8.0-8.2 三、实验仪器、材料和试剂 四、方法与步骤 1. 鸡血红细胞悬液的制备：用注射器吸入 1mL Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2mL，注 入刻度离心管内，按照3：1(V／V)加入Alsver液混匀，放入4℃冰箱保存。 2. 取细胞悬液0.2，移入EP管内，加入0.8mL0.85％Nacl混匀，1500r／min离心5 min。 3. 弃上清液(用吸管吸去)，加1mL0.85％Nacl，混匀后1500r／min离心5min。 4. 重复上述条件，再离心洗涤1次（10min)。 5. 收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入1mLGKN液使红细胞重新悬浮。 6. 取悬液1ml到1个试管中，加入0.5～0.8ml预热的50％PEG混匀，置于37℃水浴中温浴2-5min； 7. 加入GKN5ml以终止PEG的作用，在37℃水浴中静止平衡5min. 8. 取血细胞悬液1滴滴于载玻片上，再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴,用牙签混均，3min后，盖上盖玻片，高倍镜下观察细胞融合情况。 9. 进行多个视野的测定，统计平均融合率。 五、实验结果的观察与计算 细胞融合的观察，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。 细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。 六、作业 1. 画出观察到的融合细胞. 2.计算细胞的融合率： 融合率=融合的细胞核的个数 总的细胞核的个数 3. 你认为PEG介导的细胞融合实验的关键步骤是什么？说明理由。 * * * 细胞融合又称细胞杂交， 是指真核细胞通过介导 或培养，两个或多个细 胞合并成一个双核或多核细胞的过程。异核细胞可进入有丝分裂，使来自两个亲本细胞的基因组合在一起，形成只含一个细胞核的杂种细胞。 依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分3种类型： 病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ） 化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）； 电场诱导的细胞融合； 病毒诱导的细胞融合过程 利用细胞融合培育杂种植物 PEG溶液作为助融剂介导动物细胞融合的原理为：PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。 1.仪器、用具：注射器、离心机、水浴锅、EP管 2.材料：成年家鸡 3.试剂：Alsver溶液 0.85％Nacl GKN溶液 50％PEG溶液 0.2％次甲基兰 鸡是鸟类，鸡的红细胞中既有细胞核也有线粒体。因此可用鸡血细胞液进行DNA的提取。 不止是鸟类，像两栖类动物（如蛙）、爬行类动物（如蛇）的红细胞都有细胞核和线粒体。 人体和哺乳动物的红细胞中无细胞核与线粒体，不能进行DNA的提取。 诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。而化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。 电融合? 20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，在相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。 也有采用