150515-乳酸菌的生产性状和机理-以伽马氨基丁酸为例试卷.ppt

* * 如何通过优化发酵工艺确保发酵乳制品成品中有益成分的含量 Whey 甜乳清蛋白粉 CP 玉米肽粉 Corn 玉米汁 MSG 添加适量的谷氨酸钠 * 采用单因素实验分别对选定的发酵基质中各成分的添加比例进行优化，以确定GABA高产的最优发酵基质 再确定发酵过程中重要的两个发酵条件，从而确定适合GABA最大量积累的最优发酵条件 发酵基质中添加谷氨酸钠会造成味精味浓重，实验结果发现添加谷氨酸钠的 0%组也在 15mg/100mL 左右，大于 GABA 在人体内发挥功效的浓度 12mg，因此综合考虑发酵基质中不额外添加谷氨酸钠 * β-环糊精包埋：玉米肽溶液中添加 2% (w/v) β-环糊精， 50℃ 包埋 30 min, 并定时搅拌。以包埋处理后的玉米肽作为底物再进行接种发酵，可对玉米肽中的苦味肽起到包埋的效果。 发酵基质中的玉米肽经过发酵后存在苦味和涩味，影响发酵乳终产品的风味 分别从GABA含量、发酵乳饮料和活菌数三个方面比较两种方法的优劣 * 前期我们已经针对已知GABA的代谢途径来优化其产量，同时利用高密度发酵技术获得较高的活菌数，那么是否存在其他影响其产量的因素就需要我们深入的挖掘GABA的发酵机制，全面、综合进行考虑。 * 我们分别探究了发酵初始pH值、L-MSG添加量、PLP添加量、发酵温度以及钙离子添加量五个因素对菌体积累GABA的影响，利用方差分析和极差分析两种方法对正交实验实验的数据进行处理，综合考虑，我们选择对菌株积累GABA影响最为显著的因素-底物L-MSG为单一因素，采用化学成分限定培养基进行GABA的诱导发酵 * 我们分别检测了实验组和对照组在发酵过程中pH值和生物量的变化，以及发酵液中GABA的含量。结果发现，36h时，GABA的产量在实验组和对照组之间出现了最为显著的差异，产量差异多达7.7倍，说明在这一时间点，受底物的影响，菌体中关于GABA的代谢活动出现了比较明显的变化，于是我们就选择这一时间点，对菌体的转录组进行考察。 * 我们采用高通量转录组测序技术，比较实验组（受到底物诱导）和对照组（未受到底物诱导）的菌体内一整套转录本的表达情况。 结果： * 差异基因经过GO富集分析，得到这些基因相关的功能，其中主要涉及的功能分布在糖代谢、脂代谢中一些酶，以及磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶体系 * 差异基因进一步进行KEGG代谢通路的富集分析，我们得到了这些差异基因主要参与了菌体在发酵过程中的磷酸转移、丙酮酸代谢、脂肪酸合成、糖代谢等活动。也就是说由底物谷氨酸钠诱导的，在发酵过程中GABA的积累可能与上述代谢途径存在着密切的联系。这样的结果给我们一个重要的提示：我们是否可以从上述途径入手，寻找到关键的基因，从分子层面进行优化，进一步提高发酵过程中目标产物的产量。 * 我们将两种富集的结果进行发现，由L-MSG诱导的差异基因经过不同层面的富集分析后得到了有一定相关性的结果，其中丙酮酸代谢、糖酵解、磷酸转移酶体系、脂肪酸合成是两种富集分析得共有的结果，说明这些差异显著的基因主要与上述功能和代谢途径存在着联系 * 我们将两种富集的结果进行发现，由L-MSG诱导的差异基因经过不同层面的富集分析后得到了有一定相关性的结果，其中丙酮酸代谢、糖酵解、磷酸转移酶体系、脂肪酸合成是两种富集分析得共有的结果，说明这些差异显著的基因主要与上述功能和代谢途径存在着联系 荧光定量：4个关键基因是丙酮酸脱氢酶复合体的编码基因，主要参与丙酮酸途径中由丙酮酸生成乙酰辅酶A这一过程。 * * * 在深入挖掘乳酸菌关键生产性状的关键机理后，我们可以通过提高活菌数的方法来进一步实现目标产物的高产量。 1、通过响应面优化法确定基础培养基中三种增殖因子，添加后，菌体浓度较普通MRS培养基有较大幅度的提高； 2、在增殖培养基的基础上针对高密度培养过程中发酵环境pH值的调整、中和剂的选择以及补料浓度的控制三个方面进行优化，使得活菌数进一步提高到了优化前的8.7倍。 3、适宜的保护剂能够降低菌体在冻干过程受到的伤害，保证了发酵剂成品在后期储藏过程中高活菌中。 * 如何对具有潜在商用价值的乳酸菌菌株进行生产性状的优化，从而获得预期的商业价值，可以从以下三个方面的考虑： 1、在传统发酵工艺的基础上优化发酵工艺，提高目标产物的产量； 2、利用分子生物学的先进手段，全面、深入研究发酵机制，在分子层面控制发酵进程； 3、优良的高密度发酵技术以及完善的菌粉冻干和保藏技术是维持终端产品中菌株优良生产性状的关键 这三面对乳酸菌发酵性状的贡献并不是单一存在的，他们形成了一个有机的整体，要求我们能够结合具体的生产情况综合考虑。 * 乳酸菌的生产性状和机理 ——以γ-氨基丁酸为例 姜毓君 国家乳业工程技术研究中心 东北农业大学 2015.5.16 北京