第一章 核酸的制备3课件.pptVIP

二、核酸序列分析 （一）Maxam-Gilbert化学降解法测序 基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解。 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序 （二）Sanger双脱氧链终止法测序 1977年Sanger提出了“终止法”。其反应体系包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶，分四组进行，每组按一定比例加入一种2 ′, 3′双脱氧核苷三磷酸，它能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列。 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 自动化测序 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光, ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。 三、核酸纯度和浓度分析 用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng） 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0 组成核酸的嘌呤、嘧啶碱基均有紫外吸收特性。 最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。 OD值为1时，相当于大约50μg/ml双链DNA 、 40μg/ml单链DNA或RNA、 20μg/ml单链寡聚核苷酸。 通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。 紫外法仅用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。 DNA A260/A280=1.8 A260/A2801.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A2801.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A2302.0，可能有盐未除尽。 注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可 判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段 的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果 发生降解，电泳图呈拖尾状。 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。 * ①先用限制性内切酶把DNA切成10—200bp 的测序材料； ②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸； ③在5′OH端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； ④标记片段变性为单链； ⑤用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段， 产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段； ⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。 Maxam-Gilbert 法所用的化学技术 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶 C 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去 C+T pH2.0 哌