分子生物学技术1选编.ppt

核酸提取 分类： DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量 DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA RNA 主要存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等 非细胞形式存在的病毒和噬菌体（或只含DNA，或只含有RNA） DNA 片 段 的 分 离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的回收 核酸的理化性质 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解；在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。 DNA的分离与纯化 基因组DNA的分离与纯化 DNA分离纯化过程 破碎细胞 + 65℃温育（20’），冰浴冷却 DNA抽提液 (EDTA、去污剂SDS、还原剂、 RNA酶、蛋白酶K) 离心去细胞碎片 苯酚抽提法 CsCl密度梯度离心 苯酚抽提法 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。 步骤： 上清液 用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液,加入RNAase处理除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥 载体DNA的分离与纯化 质粒DNA的提取与纯化 相 关 知 识 质粒(Plasmid) ： 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 存在于细菌、放线菌、真菌 以及一些动植物细胞中，在 细菌细胞中最多。 常用的质粒载体 提纯的思路 质粒的特性： 共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA 质粒DNA的提纯方法 由于质粒的种类与性质、宿主菌的特性及后续纯化方法不同，质粒的提纯方法较多： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸法: 沸水煮沸40秒 SDS法：10%SDS 碱裂解法基本原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 操作过程 仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压 灭菌锅 （二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、LB(Luria-Bertani)液 体培养基 （三）试剂： 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0) ）　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II（0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释），1%SDS） 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性 溶液III（5mol/Ｌ乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml） 作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1