酶工程第1章兰州大学酶工程酶活性单位及其测定方法.pptVIP

第一章 酶活性单位及其测定方法 酶的活性 一、酶活性单位 国际酶活性单位 Katal 实用单位 转换数 比活性 例题 二、酶活性测定的主要方法 1 分光光度法 乳酸脱氢酶催化的反应 2 旋光测定法 3 荧光法 4 同位素测定法 5 电化学方法 6 化学分析法 * 一、酶活性单位 二、酶活性测定的主要方法 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。 要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测定方法。 酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制剂所含的酶活性单位来表示，即u/ml。对于固体状态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的酶活性单位来表示，即u/mg。 1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下（一般为酶催化反应的最适条件），1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个国际单位（IU）。 1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal（kat），katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。 1 katal＝6×107 IU 对不同的酶采用不同的定义。 DNA聚合酶Ⅰ的单位：在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量。 T4 DNA连接酶的单位：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的Hind Ⅲ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。 ACC合成酶的单位：30℃，1小时转化SAM（硫腺苷甲硫氨酸）生成1nmol ACC（1-氨基-1-羧基-环丙烷）所需的酶量。 在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的mol数，可表示为： 1/Kp为一个催化循环，单位为分钟。 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。 分子量为20,000的20μg纯酶在最适条件下催化反应的速度为0.3μmol/min，计算此酶制剂的比活力。 μmol/min/mg protein U/mg protein 温度、pH、离子强度（I=(1/2)ΣCZ2）等因素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子，应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度，即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应了的底物不超过5%）。 （spectrophotometry） 硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶，NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原形式NADH和NADPH在340nm处光吸收较大，因此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。 乳酸脱氢酶 若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。 （polarimetry） （fluorescence） 氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+ 和NADP+无荧光，而NADH和NADPH有460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。 （isotope determination） 用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或沉淀，就易于分离。 （electrochemistry） ① pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋或减少H＋的反应来说，