抗人白介素1受体单克隆抗体制备及初步鉴定.docVIP

抗人白介素1受体单克隆抗体制备及初步鉴定 　　摘要：本研究以人白介素1受体（IL-1R）蛋白免疫巴比西小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术，获得3株可稳定分泌抗人白介素1受体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5A5、5C3和1C4。ELISA鉴定结果表明，3株单抗的亚型均为IgG1，轻链为K链，腹水效价都在5×10-5以上。经鉴定证实，3株单抗均可与真核表达的人白介素1受体发生特异性反应。结果表明，本研究成功获得3株针对人白介素1受体的特异性杂交瘤细胞株。 　　关键词：人白介素1受体；单抗 　　【分类号】R735.2 　　IL-1受体有I型（IL-1R I）和Ⅱ 型（IL-1R II），人IL-1RⅠ 基因编码549个氨基酸，其中胞外区316个氨基酸，单次跨膜区20个氨基酸和胞内区213个氨基酸，分子量为80 kDa，含有3 个免疫球蛋白样结构域。VIGERS等[1] 对IL-1与IL-1RⅠ 复合物的晶体结构研究发现，IL-1RⅠ 的第1个和第2个免疫球蛋白样结构域的内部通过二硫键形成一定空间构象的刚性结构，具有不可变性，而与之相连的第3个免疫球蛋白样结构域则在一定范围内具有一定的可变性。 　　1 材料 　　人白介素-1受体：本室提供；胎牛血清，1640培养基，HT， HAT，聚乙二醇：Sigma公司；鼠源单抗亚类试剂盒：SouthernBiotech；其余生化试剂均为分析纯。 　　2 方法 　　2.1动物免疫 　　按照萨姆布鲁克J等[2]报道的方法，将人白介素-1受体作为免疫蛋白[3]。以1μg/μL的浓度，对6只7周龄巴比西小鼠进行免疫，每只接种100μL，间隔2周免疫一次，共3次，细胞融合于最后一次免疫后7天进行。 　　2.2 ELISA方法的建立 　　以人白介素-1受体蛋白为抗原包被酶标板，用碳酸盐缓冲液稀释抗原，方阵法确定蛋白最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释倍数，经HRP标记的山羊抗鼠IgG作用，邻苯二胺底物显色，判定结果。判定标准为阳性血清孔的OD492值接近1.0，阴性血清OD492值0.2，P/N≥2.1。 　　2.3细胞融合及筛选 　　抗血清效价检测于第3次免疫后7天进行。取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，按常规方法进行融合，HAT筛选融合细胞，采用有限稀释法对阳性克隆进行筛选，达到100%阳性者扩大培养，建株保存。 　　2.4单抗亚类鉴定 　　按SouthernBiotech公司亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。 　　2.5腹水制备 　　采用体内诱生腹水法，按常规方法制备腹水。用建立的ELISA检测方法测定单抗腹水效价，以P/N≥2.0的抗体最大稀释度作为效价终值。 　　2.6抗体识别特异性鉴定 　　用三株杂交瘤细胞腹水纯化后蛋白做酶联免疫吸附实验，包被蛋白为IL-1、IL-1R和IL-18bp，经鉴定3株单抗均能与人白介素-1受体反应，说明筛选得到的单抗可以特异性识别人白介素-1受体，进一步证实了所获得单抗的特异性。 　　2.7 IL-1R单克隆抗体亲和力鉴定 　　采用非竞争酶免疫法测定已获得的3株杂交瘤细胞分泌抗体的亲和力。 　　1）包被：用包被液稀释纯化的IL-1R蛋白至1.5μg/ml，0.75μg/ml，0.375μg/ml，0.1875μg/ml，，加入96孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜包被； 　　2）封闭：用PBST洗涤3次，拍干后，每孔加入200 μL封闭液，37 ℃封闭1 h； 　　3）一抗：PBST洗涤3次，拍干后，将各株IL-1R单抗浓度调整为1μg/ml，进行倍比稀释（8个梯度），每孔加入100 μL， 37 ℃孵育1 h； 　　4）二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗稀释至1：10000，每孔加入100 μL，37℃孵育1 h； 　　5）显色：PBST 洗涤3次，拍干，加入底物液（OPD），室温避光作用13 min； 　　6）终止：每孔加入50 μL终止液，轻轻振摇混匀； 　　7）测定OD492 / OD630值。 　　3 结果 　　3.1间接ELISA方法结果 　　将白介素-1受体蛋白，以4g/ml 、2g/ml 、1g/ml和0.5g/ml的浓度包被ELISA板，阳性和阴性血清稀释倍数为1：100、1：500、1：1000，结果显示，抗原浓度在1μg/ml，血清稀释倍数为1/1000时，P/N≥2.1。 　　3.2 细胞株的建立 　　细胞融合后，判定为阳性的杂交瘤细胞经3次克隆筛选，获得3株能够稳定分泌白介素-1受体单抗细胞株，分别命名为5A5、5C3和1C4。 　　3.3 单抗亚类鉴定 　　经单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测，所获3株杂交瘤细胞，均为IgG1型，轻链为K型。 　　3.4