chap 6 cell culture课件.ppt

第一节 悬浮培养(suspension culture) 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 一. 愈伤组织诱导 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 ?选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。 选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 ? 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞重量变化，即可构成该培养体系的基本参数。 生长速率（p）一般通过不同时间细胞密度（x）的自然对数与起始密度（x0）的自然对数之差与培养时间（t）的比来衡量。 ? p = （lnx – lnx0）/ t ? 单位体积的细胞重量测定细胞生长情况。细胞重量采用鲜重和干重来衡量。一般鲜重只能反应细胞的生长情况，而干重则在一定程度上反应了细胞质量。鲜重和干重的测定方法比较简单，只需按一定体积取样，经真空过滤后称重即可得到鲜重，然后在80 ℃条件下烘干细胞至恒重即可获得细胞干重。 影响悬浮细胞生长的因素： ?起始愈伤组织的质量 ?接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。 ?培养条件：方式、温度、继代周期 四.悬浮培养细胞的同步化 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，则细胞分裂又可重新恢复。 抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期－G1期的同步化细胞。 分选法：通过细胞体积大小分级将处于相同周期的细胞进行分选，将同一周期的细胞继代培养于同一体系中，使相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。 低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化。梅兴国等（2001）采用6 ℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显得同步化效果。 第二节 植物细胞规模化培养 一. 概 述 在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的天然产物，很可能发展成为一个广义的化学工业的一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可缺少。据不完全统计，至少有20％左右的药物是由植物衍生而来的，而且每年都可发现许多植物来源的新化合物。 植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义 ?李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。? 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。 规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径? 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业 植物细胞大规模培养的技术要求： 二.植物细胞规模化培养体系的建立 种子细胞选择 植物类型：植物遗传基础是天然产物生产的基本影响因素，不同植物产生的天然产物种类之所以不同，从根本上来说是因为它们具有不同的遗传基础。在确定生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及其品种或单株。 组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物次生代谢产物的积累具有组织器官特异性，因此，在起始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织为外植体。 单细胞克隆技术—细胞平板培养 所谓平板培养（plating culture）是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体培养基中进行培养的技术。 ? ?单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。 ?单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml 植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。 为了提高筛选效率，还可根据后续的培养