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AIS大家系的AR突变效应分析 　　【摘要】 目的：分析雄性激素不敏感综合征（AIS）大家系的AR突变效应。方法：从AIS患者外周血中将基因组DNA提取出来，以特异的引物聚合酶联反应（PCR）扩张雄激素受体（AR）基因，单链构象多态性分析（SSCP）扩增产物，将突变的外显子筛选出来，然后对其直接进行PCR产物测序。结果：所选取的8例人员中，有2例AIS患者缺失AR基因2号外显子，其余6例存在外显子电泳条带，经过基因测序，发现其符合正常AR基因。结论：本研究方法简便实用，在临床诊断和研究AIS中具有极为有益的应用。 　　【关键词】 AIS； 大家系； AR突变效应 　　AIS指雄性激素通过靶器官上特异的AR起作用，雄性激素在AR异常的情况下发生的作用障碍。AIS家系患者表型为X-隐性遗传，46：XY表型女性但有睾丸。新发现该家系AR受体基因2701位点C→A突变（ARG→SER）。基于本组前期研究，本研究分析了AIS大家系的AR突变效应，以明确该AIS家系致病的基因突变原因，将有可能终结该家族患病基因，帮助优生优育，并为相似疾病的临床处理提供经验。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 选取AIS家系五代中4名携带者与3名患者、1名可疑患者。所有患者均以原发闭经就诊，均具有典型的AIS，染色体核型均为46XY，经SRY检测均为阳性。患者年龄23～38岁，平均（31.2±10.4）岁；身高161～172 cm， 　　平均（166.5±5.4）cm。6例双侧性腺在腹腔内，2例双侧性腺在双侧腹股沟内。内分泌检查显示：4例血睾酮为16.7～29.7 nmol/L，正常男性水平为13.0～33.0 nmol/L；2例患者的血睾酮为2.1～2.2 nmol/L，比正常男性水平低；2例没有测定。所有患者的LH均为12.4～49 IU/L，比正常男性水平（2.5～9.8 IU/L）高。6例接受了双侧性腺切除，病例检查显示均为发育不良的睾丸，有多发性支持-间质细胞瘤、发育不良的输卵管组织等存在于其中2例患者的双侧睾丸中；2例还没有接受手术。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组DNA制备 在患者知情同意的情况下将患者的5 mL的外周静脉血取出来，然后将30 μL 0.5 mol/L的EDTA加入其中进行抗凝，对白细胞进行分离，经蛋白酶K消化后，依据常规盐析法将基因组的DNA提取出来。 　　1.2.2 寡核苷酸引物的设计 依据Lubahn等医学学者设计的引物改良原20～30个碱基的引物，使其变为18～30个碱基的引物，并运用计算机软件进行检测，符合引物的要求。中国科学院微生物研究所运用DNA合成仪将引物合成。PCR引物5’-3’的顺序具体如表1所示。 　　1.2.3 试剂 从中国科学院遗传研究所购买的10×PCR缓冲液和Taq DNA 聚合酶，从德国Beohringer公司购买4种脱氧三磷酸核苷酸，运用美国Life Technologies公司提供的药盒进行测序。 　　1.2.4 聚合酶联反应（RCR） 在内含10×2.5 μL PCR缓冲液的25 μL体系中扩增所有外显子，4种均为2.5 mmol/L的dNTP 1.0 μL，引物、模板、双蒸水、Taq DNA 聚合酶分别为0.5 μL、0.5 μL、20 μL、1U。用1滴石蜡油将其覆盖起来。具体反映程序为：第1个循环，在95 ℃的温度下进行5 min的变性，然后将1Utaq酶加入其中，在55 ℃的温度下进行1 min的复性，之后在72 ℃的温度下进行3 min的延伸。以后，在94 ℃的温度下进行1 min的变性，然后在55 ℃的温度下进行1 min的复性，之后在72 ℃的温度下进行2 min的延伸。共35个循环，最后在72 ℃的温度下保温10 min。 　　1.2.5 扩增结果检测 在2%琼脂糖凝胶中点样4 μL的PCR扩增产物，琼脂糖凝胶中含有微量溴化乙锭，将电压调整为80 V，温度调整为室温，在l×TBE （Tris-碱-EDTA）缓冲液中进行30 min钟左右的电泳，在紫外光下对特定的扩增片段的存在情况进行认真细致的观察。 　　1.2.6 单链构象多态性分析 在l×TBE（Tris-碱-EDTA）缓冲液中对比例为49：1的丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的混合物6%的聚丙烯酰胺非变性胶进行1 h的预电泳，均匀混合5 μL PCR扩增产物+3 μL单链DNA加样液之后，在95 ℃的温度下进行5 min的加热变性，冰浴中骤冷，使单链状态得以保持，以后分别点样电泳。电压、温度、电泳时长分别为600 V、20 ℃、3～4 h。结束电泳后，运用硝酸银对胶进行染色，用照相方法将结果保存下来或移动胶到滤纸上，将保鲜膜盖在其上，在真空状态下对其加热，然后抽干保存。