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PDE5 shRNA对急性心梗后早期细胞凋亡的影响 　　【摘要】 目的 探讨PDE5 shRNA对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响。方法 通过结扎小鼠左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型，随机分为实验组（n=10）：将携带有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重组腺病毒载体注射到心肌梗死区及周边区和对照组（n=10）：将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体注射到心肌梗死区及周边区。一周后，进行免疫组化和TUNEL分析检测梗死及梗死周边细胞凋亡情况。结果 心梗1周后，和对照组相比较，实验组小鼠梗死区及梗死周围区域细胞凋亡明显减少（P0.05），梗死周边心肌细胞凋亡明显减少（P0.05）。结论 PDE5 shRNA的干预可以明显减少心肌梗死及梗死周边区细胞凋亡和非梗死区心肌细胞凋亡。 　　【关键词】 短发夹RNA；干预治疗；心肌梗死；磷酸二酯酶5抑制剂 　　doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.061 文章编号：1004-7484（2013）-06-2921-02 　　近年来，随着心肌梗死存活率的大幅提高，心肌梗死后心力衰竭的发病率和死亡率都呈明显上升趋势[1]，已逐渐成为全世界范围主要的发病和死亡原因之一，如何降低心肌梗死后心力衰竭的发病率和死亡率，是心血管病防治领域中的关键问题。尽管有一系列的治疗措施，心衰患者的预后仍不尽人意[2]。心肌梗死后心肌细胞凋亡是触发心室重构导致心力衰竭的重要原因，阻止梗死后心肌细胞凋亡可以减少心室重构，改善心功能[3]。早期干预有助于延缓心梗后心衰的进展，对心梗的远期预后有不可估量的益处。 　　最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表达增加，并且会导致心梗后心室重构[4]，可能是由于cGMP/PKG信号的下降，加剧心功能恶化。PDE5抑制剂对心脏有很多益处，通过持续抑制磷酸二酯酶可以减轻心肌梗死引起的心室重构和心功能恶化，本实验主要通过研究长效磷酸二酯酶5抑制剂短发夹RNA（PDE5 shRNA）重组腺病毒载体对小鼠急性心肌梗死模型心肌细胞凋亡的影响并探讨其可能的相关机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 动物 雄性10周龄C57BL/6J小鼠（由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002），体重25-35g。 　　1.2.2 药品与主要试剂 DMEM培养基、10%FBS（Sigma公司）；Desmin一抗（SantaCruz）；TUNEL试剂盒（Roche公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PDE5shRNA重组腺病毒载体的建立 根据小鼠的PDE5A序列设计PDE5短发卡RNA，两个互补PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根据鼠PDE5序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆进入载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，获得鼠PDE5的shRNA表达载体质粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后将供体注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV 获得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，没有插入shRNA的普通腺病毒载体作为对照组，然后将携带有PDE5 shRNA和没有PDE5 shRNA普通的腺病毒载体分别转染HEK293细胞，放在DMEM和10% FBS混合培养液中培养，通过HEK293细胞扩增病毒，并经离心、提取、纯化制备高滴度重组腺病毒载体。 　　1.2.2 动物模型的制备及分组 实验用雄性C57BL/6J小鼠若干只，按照文献[5]的方法结扎冠状动脉前降支复制小鼠心梗模型，并将建立好的模型随机分为实验组（n=10）：将携带有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重组腺病毒（1x1010粒子/小鼠）注射到心肌梗死区及周边区和对照组（n=10）：将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体以同样的方法注射到心肌梗死区及周边区。随后逐层关胸。手术严格无菌操作。 　　1.2.3 组织标本处理 心脏标本的留取一周后，所有存活小鼠麻醉状态下，迅速取出心脏，冰生理盐水冲洗干净，垂直心脏长轴将其评分为2段，部分心肌置入4%多聚甲醛溶液中固定，部分放置-80℃冰箱低温保存。 　　1.2.4 细胞凋亡原位检测 对梗死及梗死周边细胞采用TUNEL法检测，