实验三 枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶课件.pptVIP

生物技术综合实验 南京师范大学生命科学学院 张茵 2010.3 实验三、枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的提取和酶活测定 实验目的 学习盐析法提取碱性磷酸酶； 学习透析法脱盐； 实验材料 菌种：枯草芽孢杆菌； 培养基：Tris培养基； 试剂：0.1M Tris-HCl缓冲液（pH7.5）， 1M MgCl2溶液， 硫酸铵固体粉末， 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH9.5），40mM NPP溶液； 仪器：离心机、水浴锅； 其它材料：透析袋（14000Da）。 实验原理 渗透压冲击法破裂细胞； 分级盐析法提取碱性磷酸酶； 透析法脱盐； 酶活测定的原理。 渗透压冲击法破壁 原理： 碱性磷酸酶前体一般存在于外周胞质中，在跨膜分泌的过程中加工为成熟的碱性磷酸酶，故成熟的碱性磷酸酶为存在于质膜上的一种膜结合蛋白。 因此本实验采用渗透压冲击法抽提碱性磷酸酶，在高渗的环境中（一定浓度的 Mg2＋溶液）使目的物慢慢分泌出来。 碱性磷酸酶的性质： 碱性磷酸酶是二聚体，单体分子量约为47KDa； 在偏酸性环境中易失活，较耐热， Mg2＋ 可增加其热稳定性； 因Zn2＋ 是保持酶活的重要离子，故提取过程中要防止金属螯合剂； 注：1、在Tris培养基中（缺磷营养胁迫下），枯草芽孢杆菌的 碱性磷酸酶合成量增加，其活性也会有所增强。 2、