实验五 DNA片段的体外连接课件.pptVIP

实验五 DNA片段的体外连接 一、实验目的 学会DNA的体外连接技术。用T4 DNA连接酶将实验四中已回收的目的基因片段与相应的载体DNA片段（用相同的酶切，含匹配的粘性末端）连接起来，构建体外重组DNA分子。 二、实验原理 体外重组DNA分子是在T4 DNA连接酶的作用下、在含Mg2+、ATP等的连接缓冲液系统中，带有匹配末端的两个DNA片段连接而成的。 DNA连接酶的作用步骤： ① T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-TMP复合物（腺苷酰酶）。 ②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA片段上，使DNA腺苷化。 ③产生一个新的磷酸二酯键，并把缺口封起来。 通过控制载体DNA与目的DNA的分子比例等来影响重组率。 一般情况下，载体DNA的摩尔数与目的基因片段的摩尔数之比为1比5；目的基因片段的比例太大，容易产生基因自连后插入载体的多聚体。连接体积太大自连机会也会增多。 （三）连接反应的条件 1、缓冲液：一般都配成5~10倍的缓冲液。缓冲液中含有Mg2+、ATP作为辅助因子以为连接反应提供能量，同时也含有一些保护和稳定连接酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）可以防止酶氧化失活，BSA（小牛血清白蛋白）可使连接反应中维持有一定浓度的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低而使酶变性失活。 2、温度：在37℃时有利于连接酶活性的发挥，但在这一温度下结合的粘性末端氢