第三章目的基因的克隆与基因文库的构建方案.ppt

A 鸟枪法（Shotgun method） B cDNA法 B 基因文库的构建 C PCR法 D 化学合成法 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点 染色体走读法（chromosome walking） 染色体走读法（chromosome walking） 走读的起点克隆片段 亚克隆旁测序列 探针标记 第一轮杂交 阳性克隆 阳性克隆 第二轮杂交 第二轮杂交 染色体走读法（chromosome walking） 走读的起点克隆片段 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 5‘ 5‘ 目的基因 5‘ 变性 加热 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加热 变性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加热 变性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取在载体末端加同聚尾dT的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆 PCR克隆目的基因的基本程序 5’ 5’ A A T T 5’ 5’ PCR扩增产物 T 载体 T7 lacZ MCS ori Apr 化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略： 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 化学合成法的基本战略 全基因合成 补钉延长法： 混合退火 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7% 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑