cDNA全场扩增学案.ppt

Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。 目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产。 5’RACE的扩增 切胶回收 克隆转化 挑取单菌落 菌落PCR检测 公司测序 5’RACE 414bp 5’RACE序列的分析 将测序得到的结果去载体与接头 接下来，将5’RACE结果与中间片段以及3’RACE片段采用DNAMAN软件进行拼接 End to end实验 在采用DNAMAN软件将克隆得到的中间片段、3’RACE片段以及5’RACE片段进行拼接后，我们还需要在序列结合处的两侧设计引物，进行end to end PCR，以确保所获得的序列是真实存在的，同时所设计引物的位置最好在开放阅读框的两侧。 同源序列比对分析 RACE技术的关键环节 RACE 技术的关键环节： 1. RNA的质量 2. RACE的引物 存在的问题及解决办法 反转录 RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 反转录提前终止