肾科实验方法汇总方案.doc

组织RNA提取 准备工作 步骤 (一) TRIzol法提取总RNA 组织(约100g)＋1ml TRIzol ↓ 匀浆(冰上预冷)(转1.5ml EP管) ↓ 颠倒混匀，室温5分钟 ↓ 加0.2ml 氯仿 ↓ 颠倒混匀15秒，室温2～3分钟 ↓ 离心：4℃，12000rpm，10分钟 ↓ 转上层水相(约400～500μl)到1.5ml EP管 注：上层RNA；中层蛋白；下层DNA ↓ 加等体积异丙醇(约400～500μl)，混匀，冰浴10分钟 注：异丙醇－20℃预冷 ↓ 离心：4℃，12000rpm，15分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加1ml 75%乙醇 ↓ 离心：4℃，8000rpm，5分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加1ml 75%乙醇 ↓ 离心：4℃，8000rpm，5分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加入30～40μl DEPC水 ↓ 立即保存于－70℃冰箱中或立即用于逆转录 测浓度： 加去离子水稀释100～600倍测260值 RNA浓度＝OD260值×稀释倍数(100～600)×40/1000 上样量＝5μg/RNA浓度 加DEPC水补足10μl (二)逆转录(