第13章-细胞衰老与凋亡讲述.ppt

细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker 有关细胞凋亡的研究表明，细胞色素C与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用。 细胞凋亡的检测 ◆形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察。 ◆DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带。 ◆TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法。能对DNA分子中3’-OH断裂缺口进行原位标记。 ◆彗星电泳法（comet assay）。 ◆流式细胞分析。 经相差显微镜观察，细胞经羟自由基（·OH）处理后，逐渐变圆，失去与周围细胞的联系，而最终从瓶壁脱落下来；而对照组显示正常的细胞形态。 ?? 彗星电泳法（comet assay）的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。 hoechst33258染色：细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。 致密浓染的凋亡细胞 正常细胞核 凋亡细胞免疫荧光图片 hTERT-bMGEs的克隆胚囊胚内细胞凋亡率的鉴定 图7-5 hTERT-bMGEs的囊胚内细胞凋亡情况的观察 (蓝色为DAPI染的细胞核，绿色为FITC标记的凋亡细胞) A: hTERT-bMGEs-28得到的囊胚；B：bMGEs-10培养得到的囊胚 Fig 7-2 Observation of apoptosis in blastocysts derived from hTERT-bMGEs (Blue indicates cell nuclei, Green indicates apoptotic cells) A: blastocyst derived from hTERT-bMGEs-28.2; B: blastocyst derived from bMGEs-10 A’ A B B’ DAPI荧光染色显示，细胞核皱缩，染色质凝聚碎裂，形成凋亡小体；对照细胞核呈现均匀，明亮的荧光。 2002年10月7日，英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨Horvitz和英国人约翰·苏尔斯顿Sulston，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究，获诺贝尔生理与医学奖。 “for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death” 三、细胞凋亡的分子机制 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。 这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。 其中研究较多的有ICE(白介素1转化酶)、Apaf-1(凋亡酶激活因子)、Bcl-2(B淋巴细胞瘤-2)、Fas/ APO-1、c-myc、p53、ATM(共济失调一毛细血管扩张突变基因)等。 Caspase家族与凋亡 Caspase家族(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶, cysteineaspartate-specific protease)：是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。 Caspase蛋白酶的特点： ①酶活性依赖于半胱氨酸(Cysteine)残基的亲核性；?? ②特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。?? ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 已经鉴定了十多种不同的Caspase Caspase-3、6、7和8，在FAS/TNF介导的程序性细胞死亡途径中起作用。 Caspase-9和3，参与线粒体中Apaf-I、细胞色素c介导的程序性细胞死亡。?? 能够被Caspase切割的靶蛋白：蛋白激酶；核纤层蛋白；细胞结构蛋白；与DNA修复相关的酶类；DNase抑制蛋白。 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其它的Caspase在其天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。 caspase超家族成员 A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构