westernblot实验技术及常见问题-珍藏版探究.pptVIP

湿转操作步骤： 1.起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形。 2.润湿：准备2张Whatman 3#滤纸、1张NC膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些）， NC膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用PVDF膜，应先在100%甲醇中浸泡，否则很难润湿。甲醇可反复利用。） 3.三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层Whatman 3#滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。 组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极） 切记：每层之间用滴管/玻棒将其中的气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！ 4.转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 ℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。 转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA，上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 转膜的注意事项： 胶在负极，膜靠近正极； 转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天 配好放4 ℃ 冰箱； 滤纸不要大过膜，防止短路； 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间 没有气泡存在，否则会导致转膜不完全； 注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因 为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会污 染膜； 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时， 通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜 槽放置在冰浴中进行转膜。 半干转移系统 半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快又好（15-45 分钟）。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。 半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于两边都是3层Whatman 3#滤纸，转移电压和时间也有所不同。 半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD以上）建议湿转。 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 膜的选择： 几种膜的对比 PVDF膜 NC膜 尼龙膜 背景 低 低 较高 蛋白结合能力 100-200 μg/cm2 80-100 μg/cm2 400 ug/cm2 机械强度 强 干的膜很脆 软而结实 溶剂抗性 强 差 差 使用前处理 甲醛润湿 缓冲液润湿 缓冲液润湿 价格 高 较低 低 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝 酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋 白探针的Western印迹过程。 转膜后检测（此步可以省略） 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使