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TAG—1与神经干细胞分化的相关性研究 　　[摘要] 目的 研究微环境蛋白TAG-1与神经干细胞分化之间的关系。 方法 使用免疫荧光染色检测神经干细胞中巢蛋白nestin的表达，并过表达TAG-1后使用实时荧光定量PCR技术分析神经干细胞中分化相关蛋白的表达变化。 结果 体外培养的神经干细胞中过表达TAG-1以后，干性相关基因nestin和转录因子SOX2 （SRY-box2）表达降低，神经元标志物神经元微管蛋白β Ⅲ（neuronal class Ⅲ β-Tubulin，Tuj1）和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达升高。 结论 TAG-1可能与神经干细胞的分化存在正相关的关系，其分子调节机制有待进一步研究。 　　[关键词] TAG-1；神经干细胞；分化 　　[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（c）-0012-03 　　近年来，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）替代疗法已被用于研究神经系统功能缺陷性疾病的治疗，如脑外伤、脑缺血、出血、帕金森病、老年性痴呆等，但其效果一直欠佳[1]。NSCs的自身内源性因素及所处的微环境调节了干细胞的增殖，决定着神经元的发生、存活、分化，是影响细胞替代疗法应用的关键。研究表明，细胞黏附分子TAG-1表达于多种神经元和胶质细胞，与神经元轴突生长相关，参与神经发生和微环境的调节[2-3]。本试验探讨体外培养成年小鼠脑室下区（subventricular zone，SVZ）NSCs是否表达微环境蛋白分子TAG-1，并探索其对NSCs分化的影响，为将来更有效的NSCs的替代疗法奠定理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂与仪器 　　实验用动物为2～4个月大的昆明小鼠，体重20～25 g，由南方医科大学实验动物中心提供。细胞培养所需的DMEM/F12培养基、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、胰酶等均购自Invotrogen公司；兔来源TAG-1抗体购自Sigma公司，HRP标记二抗购自Santa Cruz，Hochest 与nestin抗体购自Abcam，荧光二抗购自Invitrogen公司，TAG-1慢病毒及对照由百诺生物公司提供，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，Trizol与实时定量PCR试剂盒购自takara，PCR仪使用biorad C1000，荧光显微镜为德国Leica公司生产。 　　1.2 方法 　　1.2.1 NSCs的分离和培养 对昆明小鼠用1.5%戊巴比妥钠0.1 mL/20 g麻醉，在无菌条件下取出侧脑室下区外侧壁，置于预冷的磷酸酶消化液（PBS）中。加入胰酶消化并轻轻将组织吹打成小块，在37℃下孵育10 min，期间多次吹打混匀，使组织消化成单个细胞。加入NSCs完全培养基终止消化，常温3000 r/min离心3 min。弃上清，加入培养基洗涤一次，再次以3000 r/min 离心3 min。弃上清，加入培养基轻轻重悬细胞，移入培养瓶中培养。NSCs完全培养基为DMEM/F12（1∶1），每50毫升中添加青霉素-链霉素500 μL，N2 500 μL，B27 1 μL，bFGF 20 μg/L，EGF 20 μg/L，携带TAG-1的慢病毒感染。对照组使用未携带质粒的病毒进行感染，感染复数（MOI）值=20，感染后3 d收集细胞。 　　1.2.2 免疫荧光 细胞预先接种于包被了多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃片上，取出培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）轻洗2次。用4%多聚甲醛室温下固定15 min。用PBS漂洗（5 min×3次），用10%山羊血清在室温下封闭1 h；加一抗nestin（1∶300），4℃下孵育过夜。用PBS漂洗（5 min×3次），加相应的二抗室温孵育1 h。用PBS漂洗（5 min×3次），封片，在荧光显微镜下观察。 　　1.2.3 Western blot 在冰上用RIPA缓冲液提取蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白转移至多氯二苯呋喃（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入TAG-1抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜（5 min×3次），加入相应标记的HRP二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜（5 min×3次），ECL化学发光法显影。 　　1.2.4 SYBR Green实时定量PCR技术 Trizol法提取RNA，逆转录使用fermentas逆转录试剂盒。Real time PCR试剂盒购自天根生化公司，按说明书操作。采用Sybr Green两步法，95℃ 15 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。使用引物见表1。 　　1.3 统计学方法 　　应用SPS