E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建.docVIP

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建 　　【摘要】 目的 克隆E3泛素连接酶 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3， HECTD3） 基因及构建真核表达质粒。方法 提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA， 并逆转录为cDNA， 以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因， 将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）， 测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。结论 HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功， 可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。 　　【关键词】 E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒 　　泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰， 参与调控多种生物学过程， 其系统功能的紊乱与癌症发展进程密切相关[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶。有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[2]， 但是目前尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。且卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤， 仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[3]。因此本文拟克隆HECTD3基因， 并构建该基因真核表达质粒， 对进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。 　　1 实验材料 　　卵巢癌细胞SKOV-3、真核表达载体pCDNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态由本室保存。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶购自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit购自omega公司， DL2000、1Kb DNA Marker购自天根生化科技有限公司。引物由invitrogen公司合成， 测序也由该公司完成。其余试剂购自广州威佳生物有限公司。 　　2 试验方法 　　2. 1 HECTD3基因的扩增 采用Trizol法提取SKOV-3细胞RNA， 并逆转录成cDNA。以该cDNA为模板进行HECTD3基因的扩增， Forward Primer： 5’-GGCgctagcATGGCGGGTCC-TGGCCCGG-3’， Reverse Primer：5’-GGCgaattcTCACTCCTCCCAAGGGCTCATGTCA-3’， 其中小写黑体的序列表示酶切位点。 PCR结果用1%琼脂糖凝胶检测。将扩增的目的条带用胶回收试剂盒回收， 具体操作见说明书。 　　2. 2 pcDNA-HECTD3重组质粒的构建 利用限制性内切酶NheI和EcoRI， 37℃ 2 h消化真核表达载体pcDNA3.1（+）和PCR扩增得到的HECTD3基因片段， 回收载体和基因片段的酶切产物。T4 DNA Ligase 于16℃连接载体和基因片段。连接过夜后， 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞， 挑取单克隆送invitrogen公司测序。 　　3 结果 　　成功构建HECTD3真核表达质粒 　　从NCBI上得到HECTD3基因序列（gene bank number： NM_024602.5）， 该基因开放阅读框（open reading frame， ORF）全长是2586 bp， 编码861 aa。由图1.A可以看出PCR反应组在2500 bp左右有一条目标条带， 割胶回收该条带， 将回收后的PCR条带和pcDNA3.1（+） 载体用限制性酶消化， 图1.B即为消化后的pcDNA3.1（+） 载体， 该载体分子量大小为5428 bp。线性化的pcDNA3.1（+） 分子量大小与预期相符， 证明酶切反应成功。将酶切之后的载体和目的基因片段回收纯化， 连接， 并转化感受态细胞DH5α， 挑取单克隆5个， 送至invitrogen公司测序鉴定阳性克隆。阳性克隆序列在NCBI上比对序列（http：///Blast.cgi）， 将成功构建的HECTD3基因真核表达质粒命名为pcDNA-HECTD3。 　　（A）HECTD3基因的扩增：泳道1是PCR扩增反应组；泳道2是阴性对照组， 以双蒸水代替cDNA模板；泳道3是天根DL2000 Marker；泳道4是天根1 Kb DNA Marker。（B）NheI和EcoRI 限制性外切酶37℃消化载体pcDNA3.1（+） 2h， 1%琼脂糖 凝胶检测酶切效果：泳道1是天根1 Kb DNA Marker， 泳道