兔骨关节炎模型早期关节软骨及软骨下骨生化改变及二磷酸盐的干预效应.docVIP

兔骨关节炎模型早期关节软骨及软骨下骨生化改变及二磷酸盐的干预效应 　　【摘要】 目的 观察兔膝关节不稳早期关节软骨基质金属蛋白酶13（MMP13）、软骨下骨基质金属蛋白酶9（MMP9）和组织蛋白酶K（CK）的表达变化及二磷酸盐的抑制作用。方法 健康雄性新西兰大白兔60只，随机分成三组，模型组、二磷酸盐组及对照组。右膝造模。二磷酸盐组每天皮下注射二磷酸盐（利塞磷酸钠，Risedronate sodium）001 mg/kg体重。术后分别于4W、8W、12 W处死兔子各取8个右膝关节，对照组取4个右膝关节的股骨内侧髁，检测关节软骨MMP13、软骨下骨MMP9和CK表达变化，并进行统计学比较分析。结果 造模4W时各组都有MMP13、MMP9和CK阳性表达细胞。对照组和二磷酸盐组阳性细胞较少，模型组阳性细胞较多。与对照组比较，模型组差异有统计学意义（P001）。二磷酸盐组与模型组比较，差异有统计学意义（P001）。造模8W时各组都有MMP13、MMP9和CK阳性表达细胞。与对照组比较，模型组差异有统计学意义（P001）。二磷酸盐组与模型组比较，差异有统计学意义（P001）。造模12W时各组都有MMP13、MMP9和CK阳性表达细胞。对照组和二磷酸盐组阳性细胞较少，模型组阳性细胞较多。与对照组比较，模型组差异有统计学意义（P001）。二磷酸盐组与模型组比较差异有统计学意义（P001）。模型组MMP9和CK阳性数目和阳性表达率在12W较4W时显著降低（P005）。结论 膝关节不稳早期软骨下骨骨吸收明显， MMP9和CK明显增高是其原因之一。随着OA的进展，骨吸收作用逐渐减弱。二磷酸盐的抗骨吸收作用与其抑制破骨细胞产生的MMP9和CK有关。同时MMP13的结果也看出二磷酸盐作用的多样性。 　　【关键词】 　　骨性关节炎； 基质金属蛋白酶13；基质金属蛋白酶9； 组织蛋白酶K；二磷酸盐 　　骨关节炎（OA）是一种慢性、渐进性、退行性关节病变。表现为关节软骨细胞外基质（ECM）合成与降解失衡从而造成软骨变性破坏，最后引起各种临床症状[1]。近年来对其研究已从不同方面展开，而关节软骨及软骨下骨的生化改变也逐渐成为热点[2]。本研究通过建立兔骨关节炎（OA）早期模型，检测关节软骨退变过程中MMP13的蛋白表达，软骨下骨组织蛋白酶K（CK）、MMP9的变化规律，同时用新一代二磷酸盐作为干预因素，检测其效果，为临床防治该病患提供理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物 健康雄性新西兰大白兔60只，体重（2.71±025）kg，由苏州大学医学院实验动物中心提供。 　　1.2 主要设备试剂 二磷酸盐（利塞磷酸钠，Risedronate）（美国LKT laboratories Inc）， 鼠抗兔MMP13单抗由武汉博士德公司提供，鼠抗兔MMP9单抗由北京博奥森生物科技公司提供，鼠抗兔组织蛋白酶K（CK）一抗抗体由上海泛柯化学试验公司购得。 　　1.3 模型复制及处理 所有动物按随机数字表法分为对照组（n=24），模型组（n=24），二磷酸盐组（n=12）。二磷酸盐组造模后每天皮下注射二磷酸盐（利塞磷酸钠，Risedronate sodium）001 mg/kg体重，模型组和对照组给以等体积的生理盐水皮下注射。2% 戊巴比妥钠按30 mg/kg麻醉，取髌骨内侧切口。模型组和二磷酸盐组暴露前交叉韧带，中间切除约5 mm。对照组同法暴露前交叉韧带， 不予切断。术后5 d腹腔注射头孢唑啉钠500 mg/d预防感染。模型组和二磷酸盐组分别在造模后4 W、8 W、12 W各取8只，对照组取4只空气栓塞处死。截取包括股骨远端关节面的骨段。进行软骨MMP13免疫组化染色，软骨下骨MMP9和CK免疫组化染色。 　　1.4 关节软骨MMP13及软骨下骨MMP9，CK免疫组化染色检测 取股骨内侧髁远端负重关节面软骨用于MMP13免疫组化染色，取软骨下骨段（带关节软骨）用于MMP9和CK免疫组化染色。标本4%多聚甲醛固定，脱钙，系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，层厚5 μm连续冠状面切片。参照Pellerier[1]的方法在软骨切片中随机选择6个高倍镜视野（400倍）其中3个位于软骨表层和中上层，另3个位于软骨中下层和下层，计算每个视野中的阳性细胞数和细胞总数。用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示MMP13的表达量。软骨下骨MMP9，CK通过光镜下观察，细胞结构清楚，胞浆内有棕黄色颗粒且着色明显高于背景者为阳性。阳性计数：各组组织标本切片，每间隔一个高倍视野选取一个视野进行观察，每张切片观察5个高倍视野，计算阳性细胞表达数目，取其平均值。阳性细胞数75%为强阳性（+++）。 　　1.5 统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计