蛋白质组学基础.ppt

2、特点（1）银染分酸性（ AgNO3）与碱性（Ag(NH3)2+） 两种,酸性染色背景浅、容易控制，碱性灵敏度稍高， 但背景深、不容易控制。 （2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。（3）但由于存在戊二醛的特异性反应， 对下一步的酶切肽谱提取存在困难, 增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。 (三)负染 1、原理（锌-咪唑染料） 咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式 沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固， 留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域， 就是负染过程。  2、特点（1）负染能提高SDS胶上蛋白质的回收率， 负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶 显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被 检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。（2）显色过程仅需5-15min（3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子 就可转移出蛋白质。（4）灵敏度15ng。 （四）荧光染色1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。 2、特点（1）灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。（2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能， 降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。（3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能 基团数不一样，灵敏度变化不一样。 二维电泳荧光检测  染色方法 灵敏度 线性范围 与质谱兼容性 费用 硬件要求 考染 10ng 3 ++ + + 银染 200pg 7 + + + 负染 15ng 3 ++ + + 荧光标记 250pg 104 +++ ++++ ++++ （五）总 结 五、蛋白质序列测定和生物 质谱技术 质谱分析法： 质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形成 离子和碎片离子，按其质荷比(Ｍ/Ｚ值)的不同进行 分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。 蛋白质、多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子 转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、 磁场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质 离子分离开来，经过离子检测器收集分离的 离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质。 ESI：electrospray ionization，电喷雾电离 MALDI： matrix-assisted laser desorption ionization，基质辅助激光解吸电离 MALDI-TOF-MS： matrix-assisted laser desorption ionization and Time of Flight, 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 这两种电离技术可以使核酸或蛋白质、多肽等不易 挥发的生物大分子产生汽化的带单电荷或多电荷的 分子离子，从而能够测定其分子量，同时它们所具有的 高灵敏度和高质量检测范围使生物大分子的微量分析 成为可能。灵敏度可达：fmol(10-15)乃至amol(10-18) Instrumentation of MS Source: produce ions from the sample； Mass analyzer（质谱仪）: resolve ions based on mass/charge (m/z) ratio； Detector（检测器）: detect the ions resolved by the mass analyzer； Data acquisition system（数据采集系统）: control the operation and record the MS data 。 How MS Instruments Work What Do We Want from MS Data? Sensitivity: routinely obtain data on femtomole (10-15 mole) of peptides or less Resolution: reliably distinguish ions that differ in m/z values of at least 1 Da Mass accur