梅毒血清固定与外周血调节性T细胞及血清IL—6、IL—10、IFN—γ的关系探讨.docVIP

梅毒血清固定与外周血调节性T细胞及血清IL—6、IL—10、IFN—γ的关系探讨 　　【摘要】 目的：探讨调节性T细胞的变化与白细胞介素10、6（ IL- 6，10）、干扰素-γ（ IFN-γ）在梅毒血清固定机制中的作用。方法：流式细胞仪测定112例梅毒血清固定患者，155例梅毒血清转阴患者和58例正常人的外周血调节性T细胞及其特异性因子Foxp3的表达；酶联免疫吸附试验（ ELISA）方法检测其血清IL-6，IL- 10和IFN-γ的水平。结果：梅毒血清固定患者外周血CD4+的表达为（1.95±0.66%），而其中调节性T细胞比例为（24.5±7.63%），较两组对照组均显著升高（P0. 05）。结论：调节性T细胞比例的升高以及Th1 /Th2比例失衡可能导致了梅毒血清固定。 　　【关键词】 梅毒； 血清固定； 调节性T细胞； 白细胞介素6； 干扰素-γ 　　梅毒是一种由梅毒螺旋体（Treponema palladium， TP）引起的一种慢性、全身性性传播性疾病，几乎可以侵犯全身各器官、系统，造成多个器官损害；有很多研究认为，机体对T P的免疫应答主要由细胞免疫引起[1-3]。虽经正规治疗， 仍会有少数患者血清RPR反应持续阳性，这种现象称为梅毒血清固定。血清固定的发生除与药物治疗量不足、不规则或再感染有关外，机体细胞免疫功能受到一定的抑制也是重要因素[1-3]。众所周知， Th1型的细胞因子主要介导细胞免疫反应；而Th2型的细胞因子则介导体液免疫反应，并且能抑制Th1的细胞免疫[1，3，4]。本研究选取检测了代表Th1型细胞因子（ IFN-γ， IL-6）及代表Th2型细胞因子（ IL-10）在梅毒血清固定患者中浓度水平，以探讨梅毒血清固定的形成与Th1 /Th2比例失衡的关系。我们通过流式细胞仪测定梅毒患者外周血调节性T细胞与其特异性转录因子Foxp3的定量表达情况；ELISA方法检测血清中IL-12和IFN-γ的水平，分析调节性T细胞水平与IL-12和IFN-γ水平的相关性，探讨调节性T细胞及IL-10、IL-12以及IFN-γ在梅毒血清固定机制中的作用。 　　1材料与方法 　　1.1病例选择 　　病例112例为我院已经规范驱梅的治疗（苄星青霉素240万U肌肉注射，每周1次，连续3周以上）后诊断为血清固定者（早期梅毒治疗6个月，晚期梅毒治疗12个月后，其TRUST检测滴度固定在某个水平左右且不阴转持续3个月者定义为血清固定）。其中男62例，女50例；平均年龄（30.6±6.3）岁；所有患者进行血HIV抗体、RPR、TPPA及梅毒IgM抗体检测；排除再感染、神经梅毒和HIV感染；治疗后以TRUST试验血清阴性者155例为对照组A ； 以58例健康献血者为对照组B。 　　1.2方法与步骤 　　1.2.1主要试剂和仪器IL-12、IL-10和IFN-γ 的ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司） ，TPHA试剂盒（富士株式会社，日本），RPR试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司） ；荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC，CD25-PerCP-Cy5.5抗体，Foxp3荧光抗体（eBioscience公司，美国）。Quanti BRITE PE流式定量试剂盒（BD公司，美国）；RPMI 1640（Sigma）。Mode-l 680型酶标仪（BIO RAD，美国）。流式细胞仪（ BD公司，美国）。 　　1.2.2标本制备分别抽取3例梅毒患者、血清固定患者和正常对照组的空腹外周血4ml加入15%的抗凝剂乙二胺四乙酸；其中的2ml血用于流式细胞学检查，另外的2ml血低温4～5℃离心3000r/min，10min后取上层血清，弃沉淀，置于-20℃冰箱中保存用于ELISA检测。 　　1.2.3直接免疫荧光标记取抗凝全血100μl，加入荧光抗体D4-FITC，CD25-Per CP-Cy5.5各100μl。每份血标本设同型对照，对照管中加入抗凝血100μl，加入荧光抗体IgG1- FITC /PE 20μl，。 避光下室温孵育30min；加入红细胞溶解液0.5μL，孵育作用15min，1200r /min 低速离心5min，弃上清留沉淀。 　　1.2.4流式细胞检测用适量PBS液重悬细胞后用流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞的目标因子，结果采用分析软件Cell Quest进行主要参数的数据分析。 　　1.2.5细胞内Foxp3的分子定量流式细胞检测用QuantiBRITE流式定量试剂盒，参照使用说明书进行实验。测得各组微球几何平均荧光强度（GMFI）及其所对应的荧光素分子数分别取对数后求回归方程。所求得回归方程为y=1.0108x+2.4306（y为lg分子数，x为lg荧光强度）。取细胞悬液先用CD