淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞免疫调控能力的影响.docVIP

淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞免疫调控能力的影响 　　[摘要] 目的 研究淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞（MSCs）免疫调控能力的影响。 方法 从人骨髓中分离MSCs并进行传代培养，通过流式细胞术观察其表型。选取第5代MSCs进行研究，通过混合淋巴增殖反应和定量PCR方法检测淫羊藿苷对MSCs免疫抑制能力和免疫调控相关基因表达情况的影响。 结果 所获得的骨髓贴壁细胞CD34和CD45表达阴性，CD44、CD71、CD90和CD105阳性表达，符合MSCs的特征。在体外混合淋巴细胞培养体系中，淫羊藿苷处理后的MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用增强，且淫羊藿苷处理后的MSCs中表达更多的HMOX-1、IL-10、iNOS和IL-2基因，而IL-1α、IL-1β和IFN-γ基因的表达水平下降。 结论 淫羊藿苷可提高骨髓MCSs的免疫抑制能力，淫羊藿苷处理后的MSCs免疫抑制相关基因表达增加，促炎相关基因表达减弱。 　　[关键词] 间充质干细胞；淫羊藿苷；免疫调控 　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（c）-0004-04 　　间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源于中胚层，具有向成骨、软骨和脂肪细胞多向分化的潜能，另外还具有多种因子的分泌功能和表达多种胞外基质的特性。已知MSCs能够分泌干细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、巨噬细胞集落刺激因子和基质细胞衍生因子等多种细胞因子，在组织修复中发挥重要作用[1]。因此，MSCs除可用于组织修复外，还可用于多种疾病的免疫抑制治疗，如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎和移植后继发的移植物抗宿主病（GVHD）[2-4]。 　　淫羊藿（Icariin，ICA）具有强筋健骨、补肾壮阳之功效，是中医治疗骨质疏松方剂中使用频率最高的中草药之一[5]。ICA的主要化学成分是黄酮类化合物，尤以淫羊藿苷的含量最高[6]。近年来，随着中药ICA药理学的研究，其在临床上的用途也越来越广泛。有文献证明ICA可促进骨髓MSCs的成骨性分化[7]，但ICA是否会影响MSCs的免疫调控能力尚未见报道。本实验将采用混合淋巴细胞培养和分子生物学方法，以研究ICA对MSCs的免疫调控能力的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　成人骨髓来自山东中医药大学附属医院（以下简称“我院”）骨科外伤术中少量取样（1 mL，患者知情同意，共12人份），所有实验均经我院伦理委员会同意，淫羊藿苷标准品购自上海晨易生物科技有限公司。α-MEM培养基和RPMI 1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovin serum，FBS）购自GIBCO公司，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）购自RD公司，L-植物凝集素（phytohemagglutinin，L-PHA）购自Sigma公司，荧光标记鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD71、CD90和CD105抗体及其同型对照购自英国SEROTEC公司；CCK-8检测试剂盒购自济南远达晶美生物科技有限公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自天根生化科技有限公司；细胞观察使用Olympus公司IX71倒置显微镜，吸光值测定使用伯乐公司的Model 450酶标仪，PCR使用美国ABI公司的7500型定量PCR仪。 　　1.2 方法 　　1.2.1 骨髓MSCs的分离和培养 骨髓MSCs的培养：人骨髓（含肝素钠500 U/mL）1 mL加入4 mL无菌超纯水裂解30 s，迅速加入4 mL 1.8%氯化钠溶液恢复等渗，1200 r/min离心10 min，取细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中计数细胞，调整细胞数为1.0×107/mL，以每孔2 mL接种于6孔板 （Nunc公司）。MSCs培养基为α-MEM培养基（含10%胎牛血清，EGF、bFGF和VEGF各2 ng/mL）。在37℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养，此后每3天换液1次，待细胞铺满80%以上皿底时，0.25%胰蛋白酶-PBS溶液消化以1∶3传代，取第4～6代细胞进行后续实验，每日常规观察并照相。 　　1.2.2 流式细胞仪检测表型 取第5代稳定增殖细胞，使用0.25% 胰蛋白酶消化收集，取106个细胞悬浮在100 μL含1%牛血清白蛋白的PBS中，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：FITC