生精汤对乳腺癌MCF—7细胞增殖影响的实验研究.docVIP

生精汤对乳腺癌MCF—7细胞增殖影响的实验研究 　　[摘要] 目的 观察生精汤对雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，揭示生精汤的雌激素活性。 方法 选用乳腺癌MCF-7细胞株，应用细胞增殖实验 （E-SCREEN法）来检测生精汤的雌激素作用。实验可分为空白对照组与雌激素对照组（己烯雌酚，30 μg/mL）和生精汤低、中、高剂量组（分别为500、800、1000 μg/mL），观察给药前后的细胞形态学变化，并运用四唑盐比色法（MTT法）测定乳腺癌MCF-7细胞的增殖率。 结果 生精汤高、中、低剂量组均可明显提高乳腺癌MCF-7细胞的增殖率，并呈现一定的量效关系。 结论 生精汤能显著提高乳腺癌MCF-7细胞的增殖率，即具有明显的雌激素样作用。 　　[关键词] 乳腺癌MCF-7细胞；生精汤；细胞增殖 　　[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）17-0129-03 　　多囊卵巢综合征（PCOS）是妇科临床常见的内分泌失调性疾病，近年来发病率呈上升趋势[1]。中医中药从整体观念出发，治疗本病有独特优势。生精汤即为经过多年临床证明能有效治疗多囊卵巢综合征的中药复方[2，3]，由菟丝子、淫羊藿、女贞子、补骨脂等药配伍而成。据文献报道，生精汤中的组成中药如菟丝子[4]、淫羊藿[5]、女贞子[6]等提取物均具有雌激素样作用，提示本方可能是通过雌激素样作用来对抗多囊卵巢综合征中的雄激素过多，调节下丘脑-垂体-卵巢轴的内分泌系统紊乱，从而起到治疗作用。MCF-7细胞增殖实验即E-SCREEN法作为评价药物雌激素活性的一种经典方法，灵敏度高，方便快捷，其原理是根据雌激素受体（ER）阳性的MCF-7乳腺癌细胞株，可在雌激素或雌激素样物质的刺激下发生增殖[7]。因此，本实验利用ER阳性乳腺癌MCF-7细胞增殖实验，观察生精汤对乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用，评价其植物雌激素活性，揭示其对多囊卵巢综合征的作用机制，为指导临床妇科疾病用药提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1 实验材料 生精汤由以下各味中药组成：菟丝子、淫羊藿、女贞子、补骨脂、熟地、山药、鸡血藤、刘寄奴、王不留行、制香附、生麦芽，均购置于浙江中医药大学中药饮片厂。 　　1.1.2 细胞株 人乳腺癌MCF-7细胞株购自于中国科学院上海细胞生物学研究所。本实验室液氮保存。 　　1.1.3 主要试剂 阳性药物为己烯雌酚，北京益民药业有限公司生产，批号0504100。胎牛血清（08028）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；培养基RPMI1640（12100-045）为Gibco公司产品；噻唑蓝MTT（08002）为华美生物工程公司进口分装产品；1：250胰蛋白酶（080535）为吉泰科技有限公司进口分装产品；二甲基亚砜（分析纯，54186）为江苏鸿声化工厂产品；青霉素和链霉素来自于上海先锋药业有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 主要试剂的配制 ①D-Hanks液配制 于700 mL重蒸水中分别加入8.00 g NaCl、0.40 g KCl，0.06 g Na2HPO4·7H2O，0.06 g KH2PO4、0.35 g NaHCO3及0.02 g酚红，定容至1 L，调pH值至7.2～7.4，分装于小瓶后10磅30 min高压灭菌。②胰蛋白酶溶液配置 1：250胰蛋白酶2.5 g，溶于1L经高压消毒灭菌的D-Hanks中， 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装储存于-20℃冰箱备用。使用时加D-Hanks溶液稀释成0.08%的胰蛋白酶溶液。③培养液配置 约300 mL三蒸水中缓慢加入培养基干粉，搅拌使之溶解；再将NaHCO3溶于约200 mL三蒸水后加到上述溶液中，定容至1 L，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装保存于-20℃冰箱备用。使用时加青霉素和链霉素（终浓度均为100 U/mL）以及灭活新生牛血清（终浓度为10%～20%）。④抗生素液配置 青霉素和链霉素溶于D-Hanks溶液中，使其终浓度均为10000 U/mL， 0.22 μm微孔滤膜负压过滤除菌后分装储存于-20℃冰箱备用。⑤PBS溶液配置 于700 mL蒸馏水中依次加入8.00 g NaCl、0.20 g KCl、1.56 g Na2HPO4·7H2O和0.20 g KH2PO4，定容至1 L，充分混匀，分装后10磅30 min高压灭菌。 　　1.2.2 细胞培养 将人乳腺癌MCF-7细胞接种于含10%胎牛血清、100 U /mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI1640培养液中，在体积分数为5%CO2、37℃恒温条件下进行培养。每日观察细胞生长情况，换液周期为2～3 d一次，