吸毒者淋巴细胞基因组甲基化水平与T淋巴细胞亚群变化的相关性分析.docVIP

吸毒者淋巴细胞基因组甲基化水平与T淋巴细胞亚群变化的相关性分析 　　【摘要】 目的：探讨康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和T细胞亚群间的相关性。方法：抽提康复期强制戒毒人员和正常人淋巴细胞基因组DNA，采用整体甲基化定量试剂盒检测基因组DNA甲基化水平；T细胞亚群检测采用流式细胞术。结果：分别对80例康复期强制戒毒人员和正常健康人群进行淋巴细胞基因组DNA甲基化水平检测发现，康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化百分率为（15.37±3.28）%，显著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差异具有统计学意义（P0.05）。康复期强制戒毒人员CD3+、CD3++CD4+和CD3++CD4+/CD3++CD8+均明显低于正常健康人群（P0.05）。且CD3+、CD3++CD4+与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平呈正相关（r=0.21，0.36，P0.05）。结论：康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著低于正常人水平，其淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和CD3+、CD3++CD4+明显相关。 　　【关键词】 毒品； 甲基化； 淋巴细胞； 细胞免疫 　　人体免疫系统是由多种免疫细胞、免疫分子共同参与，形成复杂的网络结构而发挥作用。其中淋巴细胞对免疫应答的启动起着至关重要的作用。研究发现，吸毒人群的免疫系统受到极大破坏，淋巴细胞的活性也受到破坏[1]。而在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身性免疫疾病中，均发现其淋巴细胞DNA甲基化水平发生异常[2]。吸毒所导致的免疫力低下，与淋巴细胞甲基化水平是否存在特定规律，这是本研究的主要着眼点。本研究通过检测康复期强制戒毒人员外周血淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和T淋巴细胞亚群变化，研究吸毒者免疫力受损与DNA甲基化的关联，为探讨毒品对免疫病理损伤可能机制提供理论参考。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 本试验于2002年9月-2002年12月间进行。以80例康复期强制戒毒人员为研究对象，其来源于福建省司法厅所属强制戒毒场所自愿参加戒毒的人员，男40例，女40例，平均年龄（32.16±0.98）岁；符合ICD-10阿片类药物依赖诊断标准和苯丙胺类药物依赖诊断标准的脱毒患者；经告知同意，自愿参加，并签署知情同意书；排除HIV、肺结核、肝炎等传染性疾病患者，排除肝、肾、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群为对照，采集静脉血样，其来源于福建省二人民医院健康体检中心参加体检且身体健康无重大疾病者，男40例，女40例，平均年龄（29.33±2.41）岁。两组在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P0.05），具有可比性。 　　1.2 主要仪器和试剂 多功能酶标仪Infinite M200 F200（奥地利TECAN）；流式细胞分析仪EPICS XL（美国Coulter）；超低温冰箱Premium Range（美国NBS）；超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）；生化培养箱SHP-250（上海精宏）；台式离心机（美国EPPENDORF）；可调式移液器（美国EPPENDORF）。 　　淋巴细胞基因组DNA抽提试剂盒（美国Omega公司）；整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）；单克隆抗体（美国BD公司）。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 外周血T淋巴细胞亚群检测 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小试管底部，分别加20 μL荧光标记的单克隆抗体，混匀，室温（18～25 ℃）孵育15 min。加红细胞溶解液1 ml，充分混匀。待红细胞完全溶解后上流式细胞仪检测。在波长488 nm时，计数30 000个细胞。记录分析直方图，数据经ELITE软件处理，以百分率报告。 　　1.3.2 淋巴细胞基因组DNA的提取 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于EDTA抗凝管中。供试血样淋巴细胞基因组DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美国Omega公司），按试剂盒说明进行，抽提的DNA保存于-20 ℃备用。 　　1.3.3 DNA含量测定及纯度鉴定 取抽提好的DNA溶于双蒸水中，于超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）上测量260/280 nm光密度值。保证供试样本A260/280比值均在1.7～1.9之间，浓度在50～100 μg/ml，以用于整体DNA甲基化水平的测定。对不符合要求的DNA样本重新进行抽提和定量。 　　1.3.4 淋巴细胞整体基因组甲基化水平测定 DNA整体甲基化水平采用整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）检测。该试剂盒采用抗原抗体结合的方法，将DNA固定到一个对DNA具有高