大鼠去骨瓣减压术后水孔蛋白—4表达变化的实验研究.docVIP

大鼠去骨瓣减压术后水孔蛋白—4表达变化的实验研究 　　【摘要】 目的：研究去骨瓣减压术对大鼠创伤性脑损伤后脑水肿、水孔蛋白-4（AQP-4）表达的影响。方法：应用改良Feeney’s自由落体脑损伤打击装置制成大鼠创伤性脑损伤模型，分为假手术组（SO组）、对照组（C组）及去骨瓣减压组（DC组），各组在损伤后再分为6、12、24、72、120 h及168 h等6个时间点断头取脑损伤区组织。分别利用干湿重量法测量脑组织含水量和Western-Blot检测AQP-4蛋白的表达。结果：大鼠去骨瓣减压组脑组织含水量及AQP-4蛋白表达呈现先升高后降低的趋势，于伤后24 h达高峰后逐渐下降。与C组相比，上述指标含量均有所下降：脑组织含水量在24、120、168 h差异有统计学意义（P0.05），72 h差异有高度统计学意义（P0.01）；AQP-4蛋白表达在12、120 h时间点有统计学意义（P0.05），24、168 h时有高度统计学意义（P0.01）。结论：创伤后大鼠脑组织脑水肿与AQP-4表达上调密切相关；去骨瓣减压术可减轻脑水肿，减缓AQP-4表达。该手术对创伤性脑损伤的保护机制可能与减缓AQP-4蛋白表达，从而减轻脑水肿和继发性脑损伤，保护脑组织有关。 　　【关键词】 去骨瓣减压； 水孔蛋白-4； 创伤性颅脑损伤； 创伤性脑水肿 　　随着社会经济的不断发展，交通与工伤事故所致的颅脑创伤有逐年增多的趋势，现已成为国内外1个致残致死的主要原因。近年来，国内外许多临床研究表明标准外伤去大骨瓣减压术能降低颅内高压患者的致残率及死亡率，但较高的致残率以及部分患者疗效欠佳也引起临床的重视。一系列关于去骨瓣减压术的基础实验研究近年来也在陆续开展，目的在于研究颅内高压去骨瓣减压术后脑循环脑代谢的变化。但国内外从分子水平上探讨去大骨瓣减压术的脑保护机制的研究却很少。近年来发现AQP-4是广泛分布于脑组织的一种与水通透相关的细胞膜转运蛋白，对脑组织水的转运和平衡调节发挥重要作用，与脑水肿有着密切关系。本研究就是通过建立创伤性脑损伤动物模型，探讨AQP-4在创伤性脑水肿的发生、发展中的作用；并结合去骨瓣减压术，探讨去大骨瓣减压术对创伤性脑损伤（TBI）保护作用的可能机制，从而为创伤性脑水肿的临床治疗寻求新的治疗靶点和途径。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组 SPF级成年雄性SD大鼠，体重250～350 g，由汕头大学医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组（sham operation group，简称SO组，18只钻孔，不打击），对照组（control group，简称C组，36只，钻孔后只打击，不减压）和去骨瓣减压组（decompressive craniotomy group，简称DC组，36只，钻孔打击后行去大骨瓣减压术）。各组再分损伤后6 h、12 h、24 h、72 h、120 h和168 h等6个时间点，每个时间点6只大鼠（假手术组每个时间点3只）。 　　1.2 主要试剂 兔抗鼠AQP-4单克隆抗体（Sigma公司）；羊抗兔抗体（Sigma公司）；PVDF膜（PALL公司）等。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 脑损伤模型的建立 采用改良Feeney’s自由落体脑损伤装置制成大鼠创伤性脑损伤模型[1]。实验大鼠经10%水合氯醛0.3 ml/100 mg腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，头顶正中稍偏右纵行切开头皮约2.5 cm，剥离骨膜，暴露右顶骨，用微型颅钻在冠状缝后1.5 mm，中线旁2.0 mm处钻一直径5.0 mm骨窗，保持硬膜完整。将撞击圆锥置于硬膜上，用40 g砝码于25 cm高处沿空心导管坠落，通过撞击圆锥间接撞击硬膜，致右顶叶重型脑挫裂伤，打击后计时。C组大鼠止血后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮；DC组钻孔打击后同时行去大骨瓣减压术，形成大小约0.8 cm×1.0 cm减压骨窗，放射状剪开硬膜，止血后缝合颞肌、头皮；SO组仅钻孔，不打击。各组在6个相应时间点快速断头取损伤处脑组织，每只大鼠损伤边缘处脑组织分为两部分，分别用来测定脑组织含水量，AQP-4蛋白表达。 　　1.3.2 脑组织含水量测定 取损伤区左缘脑组织（200±20）mg， 　　分析天平称湿重后置于100 ℃恒温干燥箱内干燥48 h至恒重，称干重后按Elliot公式计算脑组织含水量：脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。 　　1.3.3 Western-Blot法检测脑组织AQP-4蛋白表达 取损伤区后缘脑组织（50±20）mg，加入裂解液剪碎组织并置于冰上匀浆机上匀浆，4℃下12 000 r/min离心5 min后，利用紫外分光光度计检测总蛋白浓度。取上清液加入SDS加样缓冲液，煮沸5 min离心后-20℃保存。取总