大鼠缺血再灌注损伤肾脏组织中褪黑素受体表达情况研究.docVIP

大鼠缺血再灌注损伤肾脏组织中褪黑素受体表达情况研究 　　[摘要] 目的 研究褪黑素受体（MR）在缺血再灌注损伤（I/R）大鼠肾脏组织中的表达情况及意义。 方法 24只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组和肾脏I/R组，每组8只。采用双侧肾蒂夹闭60 min后再灌注建立I/R肾脏损伤动物模型。术后24 h常规生化法检测血肌酐、尿素氮的水平，HE染色观察肾脏组织学改变。荧光定量PCR（RT-PCR）检测肾脏组织中褪黑素受体MT含量。 结果 以U6为内参基因，荧光定量PCR显示正常情况下大鼠肾脏组织中MR1和MR2 mRNA表达强度分别为（0.75±0.16）和（0.64±0.10），I/R处理24 h后肾脏组织中MR1和MR2的表达强度分别为（0.37±0.08）和（0.28±0.05），较正常组和假手术组显著下降（P 0.01）。 结论 MR在I/R损伤大鼠肾脏组织中的表达明显下降，提示MR表达与肾脏应激损伤相关，可能作为判断肾脏I/R损伤程度的指标或治疗的靶点。 　　[关键词] 褪黑素受体；再灌注损伤；肾脏 　　[中图分类号] R692 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）20-0001-03 　　肾脏为高灌注器官，因而缺血再灌注损伤（I/R）在缺血性急性肾损伤的病理过程中起重要作用，是临床常见的一个多因素、多途径的复杂的病理过程[1]。然而，I/R的发生机制尚未完全阐明，目前认为氧自由基是I/R发病过程中的重要因素[2]。褪黑素（melatonin，MT）是松果腺分泌的神经内分泌激素，具有广泛的生理作用，如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及调节免疫系统等。研究证实，MT主要通过直接清除自由基和调节抗氧化酶发挥抗氧化作用[3，4]。褪黑素受体（MR）在人体器官组织中广泛分布，褪黑素与其特异性膜受体结合后发挥生物学效应。研究证实，应激状态时组织细胞中MR降低[5，6]。本实验我们建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型，通过研究MR在缺血再灌注损伤大鼠肾脏的表达水平，进一步阐明I/R的发生机制以及MR在I/R中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物模型的建立及分组 　　选取体重为250～280 g的SD大鼠24只，分为以下3组：①缺血再灌注组（n = 8）：2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠（45 mg/kg体重），500 u肝素钠腹腔注射，进腹后游离双侧肾脏，切除右肾，夹闭左肾动、静脉45 min，然后开放，缝合腹壁。②假手术组（n = 8）：手术步骤与缺血再灌注组相同，但仅切除右肾，不夹闭左肾动、静脉。③正常对照组（n = 8）：大鼠正常喂养，不做任何预处理。 　　1.2 主要仪器和试剂 　　Trizol试剂（美国GIBCO公司）；Taq DNA聚合酶（日本Takara公司）；10000×SYBR Green（美国Invitrogen公司）；MMLV反转录酶和RNA酶抑制剂（美国epicentre公司）；UniCalD×C800全自动生化仪（美国Beckman公司）；ABI PRISM 7900 实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；MTI、MT2受体引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供。 　　1.3 标本采集和处理 　　实验大鼠分别于手术24 h后开腹经腹腔静脉采血，3 000 rpm/min离心15 min，取上清（血清）用于血肌酐和尿素氮水平检测。处死各组大鼠，获取肾脏组织。一部分在无RNA酶的研磨器内加液氮反复研磨成粉状，然后每50～100 mg组织样品，加入1 mL的TRIZOL试剂，置于1.5 mL微量离心管并充分混匀，置于-80°C冰箱备用；另一部分用10%中性甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋。 　　1.4 观察指标 　　①肾功能检测：采用日本Olympus公司Au2700型全自动生化分析仪检测大鼠血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）浓度水平。②肾组织的病理学观察：取各组大鼠同一部位肾脏组织常规制成石蜡标本，切片行HE染色，200倍光镜下观察肾间质小管病变程度。 　　1.5 RT-PCR测定MT1和MT2表达水平 　　MR1、MR2受体引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供（引物序列见表1）。①总RNA的提取：采用Trizol法提取血清总RNA，异丙醇法浓缩RNA。NanoDrop ND-1000测定RNA浓度并评估纯度，Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA分子完整性。②逆转录反应：使用MMLV反转录酶进行逆转录反应（按epicentre公司说明书规范操作）。③荧光定量PCR反应：将试剂按说明书要求加入于反应管中并置于PCR仪上。反应条件如下：94℃ 1 min， 55℃ 1 min，72℃ 2 min延伸，40个循环。扩增反应结束后继